Совершенствование технологии введения и культивирования изолированных тканей растений винограда в условиях in vitro

Введение. Для увеличения срока эксплуатации виноградных насаждений необходим переход к их закладке сертифицированным посадочным материалом [1].

Микроклональное размножение является одним из современных способов репродуцирования растений в культуре тканей и клеток [2]. Полученные растения in vitro генетически идентичны исходному экземпляру. При использовании данного способа происходит освобождение тканей микропобегов от возбудителей многих заболеваний, снижающих урожайность виноградных насаждений до 30–80 % и продолжительность эксплуатации в 1,5–2 раза [3].

Процесс размножения in vitro состоит из следующих методических этапов: интернирование эксплантов и их обеззараживание, обособление апекса, индукция адвентивного побегообразования, укоренение побегов, получение пробирочных растений и их размножение, высадка растений-регенератов в почвенный субстрат.

Получение оздоровленных методом in vitro растений связано с оптимизацией условий их культивирования на каждом этапе [4, 5]. К резкому снижению скорости роста и размножения, а также к ухудшению физиологического состояния регенерантов приводят даже небольшие отклонения от оптимума [6, 7].

Одним из важных условий при работе с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности [8]. Питательная среда – хороший субстрат для развития микроорганизмов. Изолированные от растения апексы, которые высаживаются на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами [9]. Для этого, чтобы предотвратить заражения апексов сортообразцов растений, необходимо проводить как стерилизацию эксплантов, так и самой питательной среды, на которой будут культивироваться апексы [10–12].

Результативность клонального микроразмножения, как отмечают ряд авторов научных исследований, в значительной степени определяется правильным выбором питательных сред, так как состав среды является важнейшим фактором для эффективного морфогенеза и дальнейшего успешного развития первичных эксплантов. Детализированный состав питательных сред, отработанный для одних сортообраз-цов, в полной мере не может соответствовать для других [13–15].

Таким образом, эффективность микрокло-нального размножения зависит от многих факторов: морфогенетического потенциала размножаемого растения, стерилизующих веществ при введении в in vitro , от размера, вырезаемого меристемного апекса, состава питательной среды, влажности и температуры на различных этапах, укоренения микрорастений, адаптации винограда к условиям in vivo. Для этого важное значение приобретает изучение того или иного фактора на каждом этапе культивирования микрорастений.

Цель исследований – совершенствование некоторых элементов технологии микрокло-нального размножения винограда in vitro путем подбора эффективного стерилизующего вещества для вводимых эксплантов и оптимальноприемлемого состава питательной среды для получения безвирусных клонов с целью производства здорового посадочного материала винограда.

Объекты и методы. Объекты – технические сорта винограда Гранатовый (Vitis Vin.), Достойный (Vitis Vin.) и Красностоп АЗОС (Vitis Lab.). Опыт проводился на базе селекционно-биотехнологической лаборатории СКФНЦСВВ, г. Краснодар, 2020–2022 гг. В качестве исходных эксплантов в культуре in vitro использованы меристемы генотипов винограда размером 0,3– 0,5 мм. Для стерилизации эксплантов примене- ны: этиловый спирт (70 %), пероксид водорода (3 %), дезинфицирующие таблетки ОКА-ТАБ, содержащие 50 % активного хлора (обработка 0,5 %-м раствором в течение 5 минут с 3-кратной промывкой дистиллированной водой). Для введения сортообразцов винограда in vitro использованы среды – Murasige-Skuga (MS – контроль) (Тимофеева С.Н., Смолькина Ю.В. и др. Технологии микроразмножения in vitro: учеб.-метод. пособие. Саратов, 2016; Реброва А.Н. Патент № 2636030. Питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условиях in vitro, 17.11.2017). Закладку опытов проводили в трехкратной повторности, в одной повторности 30 пробирок. Наблюдения в опытах проводились по общепринятым в биотехнологии методикам П.Я. Голодрига (1986), Н.П. Дорошенко (2012).

Результаты и их обсуждение. Наиболее действенным стерилизатором из экспериментальных веществ оказалось погружение эксплантов винограда в хлорсодержащий раствор (таблетки ОКА-ТАБ, 50 % активного хлора). Доля асептических жизнеспособных эксплантов составила 53 %. Применение этилового спирта, пероксида водорода характеризуется меньшим процентом выживаемости эксплантов растений винограда ввиду недостаточно эффективной стерилизации (рис. 1).

Рис. 1. Доля эксплантов, % асептических жизнеспособных эксплантов

Прошедшие стерилизацию фрагменты растений высаживали в пробирки на питательные среды, приготовленные по прописи Murasige-Skuga (MS) и модифицированные по прописи А.Н. Реброва. Результаты культивирования первичных эксплантов в течение 18 дней в беспересадочной культуре показали, что повышенная регенерационная активность меристем винограда наблюдалась на экспериментальной среде по прописи А.Н. Реброва (рис. 2).

сг я н к л ч я и

^ U о S и я к я £

Сорт винограда

Рис. 2. Приживаемость меристем селекционно-ценных генотипов в культуре in vitro

Сравнение регенерационной активности изучаемых генотипов винограда показало, что приживаемость эксплантов сортов Гранатовый и Красностоп АЗОС была выше на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва, чем в контроле, на 33,4 и 10 %. Адаптированность меристем сорта Достойный к контрольной и модифицированной среде не показало существенного различия и составила всего 1,0 %.

Для изучения влияния регуляторов роста на укоренение, рост и развитие растений винограда in vitro на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва были использованы два варианта сочетания 6-БАП и ИУК, в качестве контроля использована среда с содержанием 6-БАП-1 мг/л (рис. 3).

■ Гранатовый □ Достойный ОКрасностоп АЗОС DHCP05

Рис. 3. Регенерация сортов винограда на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва с различным содержанием регуляторов роста (через 30 дней культивирования)

На основании полученных данных учетов и наблюдений было отмечено, что лучшее развитие генотипов отмечалось на исследуемой среде, содержащей 1,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК. Приживаемость микрорастений сортов Гранатовый, Достойный, Красностоп АЗОС была выше на 11,1 и 11,7 %, чем в контроле, и составляла 29,4 %, 31,2 и 41,5 %. В контрольном варианте – среда с содержанием 6-БАП-1 мг/л, регенерация исследуемых сортов составила 18,3 %, 19,5 и 29,8 %.

В ходе наблюдений была выявлена закономерность, что развитие пробирочных растений происходит не линейно и зависит от следующих факторов: периода развития и сортовой специфики.

Заключение. На этапе введения в культуру in vitro винограда наиболее эффективный стерилизующий агент – таблетки ОКА-ТАБ (50 % активного хлора). Доля асептических жизнеспособных эксплантов составила 53 %.

Оптимизирован компонентный состав питательной среды для выращивания сортов винограда Гранатовый, Достойный и Красностоп АЗОС в культуре in vitro . Приживаемость микрорастений на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва с добавлением регуляторов роста 1,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК составила для сорта Гранатовый – 29,4 %, Достойный – 31,2 и Красностоп АЗОС – 41,5 %.