Современные представления о CAR T-клеточной терапии

Иммунная система. Иммунный ответ осуществляется посредством двух форм иммунитета: врожденного и приобретенного (адаптивного). Врожденный иммунитет распознает чужеродные антигены, не нанося вреда клеткам и тканям организма. Распознавание чужеродных антигенов вызывает ответную реакцию воспаления и фагоцитоза с участием врожденных иммунных клеток (нейтрофилы и макрофаги). Такой ответ происходит быстро. Адаптивный иммунитет требует больше времени для формирования ответа. В тимусе в течение первого года жизни человека развиваются Т-клетки, которые отражают ненаследуемые материнские аллоантигены, поскольку они вероятно, не подвергались иммуностимуляции патогеном [1]. Воздействие различных антигенов улучшает процесс адаптивного иммунитета. Т-лимфоциты, являясь ключевым звеном адаптивного иммунного ответа, обладают следующими эффекторными функциями: 1) уничтожение инфицированных или опухолевых клеток (цитотоксические Т-лимфоциты); 2) активация (Т-хелперы) макрофагов, В-клеток, секреция цитокинов; ослабление иммунных реакций.

Иммунная система и онкология. Критическим компонентом адаптивного иммунитета является способность Т-клеток распознавать патоген-ассоциированные иммуностимуляторы по топографии эпитопа чужеродного антигена. Процесс развития опухоли и изменение ее свойств при взаимодействии с иммунной системой, в том числе с участием Т-клеток, сформировался как концепция «иммуноредактирования рака». Основные фазы взаимодействия опухоли и иммунной системы: 1) элиминация; 2)равновесие и 3)ускользание [2]. Переориентирование иммунной системы опухолью возможно вследствие ее пластичности.

Рис. 1. Процесс взаимодействия иммунной системы и опухоли [2]

Во время фазы «элиминации» чужеродные эпитопы, продуцируемые раковыми клетками устраняются Т-клетками, что согласуется с теорией иммунного надзора, когда иммунная система активно ищет раковые клетки и устраняет их [3]. По мере роста опухоли включаются механизмы,связанные с ангиогенезом и локальным воспалением,что ведет к сильному иммунному ответу с вовлечением NKT, NK, γδ T-клеток, макрофагов и дендритных клеток продуцирующих IFN-γ [1, 3]. IFN-γ создает прямые и непрямые механизмы клеточной гибели и, как следствие, ведет к образованию клеточного детрита,который попадает в лимфатические узлы, где дендритные клетки косвенно активируют CD4 и CD8 Т-клетки. В конечном итоге, CD4 и CD8 Т-клетки мигрируют к опухолевому очагу, чтобы «убить» опухолевые клетки [4].

Фаза «равновесия» наступает тогда, когда раковые клетки погибают с той же скоростью с какой происходит их рост. Если оставшиеся после фазы «элиминации» опухолевые клетки мутируют и размножаются таким образом, что динамическое равновесие сдвигается в сторону роста опухоли, то, согласно Дарвиновской эволюции, те клетки, которые приспособились к иммунному ответу, могут размножаться бесконтрольно [3].

Таким образом, фаза «ускользания» из-под иммунного надзора происходит, когда раковые клетки становятся неузнаваемыми для иммунной системы,посредством мутаций в генах или под влиянием эпигенетических факторов. Процесс дальнейшего подавления иммунного контроля продолжается путем формирования микроокружения опухоли [3].

Мутации на клеточной мембране,которые не распознаются иммунной системой,пред-ставляют особый интерес для иммунотерапии. Необходимо понимать, что процесс распознавания лимфоцитами целого спектра антигенов которые могут быть различны по своей иммуногенности, не представляется возможным рассматривать в простой бинарной системе.

История. Концепция создания химерного антигенного рецептора принадлежит G. Gross и его коллегам, которые в 1989 г. обнаружили возможность перенаправлять Т-клеточный ответ с помощью сконструированного искусственного рецептора. Это исследование заложило основу для разработки CAR первого поколения клеток [5]. Годы последовательных и масштабных испытаний ознаменовались первым успешным клиническим применением CAR T-клеток 1-го поколения (α-GD2 CAR) о котором в 2008 г. сообщили M. Brenner et al.: у трех из 11 пациентов с нейробластомой была достигнута полная ремиссия заболевания [6 7]. С этого момента началось бурное развитие данной биотехнологии.

Химерный антигенный рецептор . Химерный антигенный рецептор состоит из внеклеточного домена — одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела (single-chain variable fragment, scFv) и внутриклеточных сигнальных доменов,состоящих из ζ-цепи CD3 и дополнительных ко-стимулирующих молекул. Вне- и внутриклеточный домены связаны с помощью внеклеточного шарнира (spacer)и трансмембранного домена. Активация Т-клеток происходит в процессе передачи сигнала от внеклеточного домена,который распознает ассоциированный с опухолью антиген (tumor associated antigen, TAA), через трансмембранный домен на внутриклеточный [7]. Такая структура CAR заставляет Т-лимфоциты специфически реагировать на опухолевые клетки с избранными антигенами.

В настоящее время существует 4 поколения CAR, отличающихся между собой по строению внутриклеточного домена. Внутриклеточный домен химерных рецепторов 1-го поколения состоит только из ζ-цепи CD3, в то время как у химерных рецепторов 2-го и 3-го поколений он состоит из одной или двух костимулирующих молекул, таких как CD27, CD28, CD134 (OX-40) CD137 (4–1BB) [7]. Костимулирующие молекулы усиливают литическую и пролиферативную активность CAR T-клеток. Но, наличие второго костимулирующего домена в химерных рецепторах 3-го поколения увеличивает активность CAR T-клеток, что приводит к усилению выброса цитокинов [1]. Это ограничило применение рецепторов 3-го поколения,в то время как химерные рецепторы 2-го поколения находятся на различных этапах клинических испытаний. Последнее, 4-е поколение — Т-клетки перенаправленные для универсального цитокин-опос-редованного уничтожения (T cells redirected for universal cytokine-mediated killing, TRUCKs) которые активируют врожденную иммунную систему посредством депонирования интерлейкина-12 (ИЛ-12) в опухолевом очаге [8].

Рис. 2. Поколения химерных антигенных [1]

Приоритетом разработки внеклеточного домена является поиск подходящих мишеней которыми обычно являются поверхностные антигены, эпитоп которых уникален для раковых клеток.

Таблица 1

Мишени в CAR T-клеточной терапии (адаптировано из [1, 7])

Опухоль	Антигены, на которые нацелены CAR
Онкогематологические заболевания	CD19
	CD20
	CD22
	CD30
	CD33
	CD38
	CD138
	ROR1
	Lewis(Le)-T (Ley)
	α-цепь рецептора интерлейкина-3 (ИЛ-3)
	Igκ легкие цепи
	Антиген созревания В-клеток (B cell matura^on an^gen, BCMA) [9, 10].
	Лиганд NKG2D [11].
Немелкоклеточный рак легких	Рецептор эпидермального фактора роста (Epidermal growth factor receptor, EGFR)
Меланома	HLA-A1/MAGE-A1
	Ганглиозид GD2
Нейробластома	L1-клеточная молекула адгезии (CD171)
Глиома	EGFRvIII
Рак предстательной железы	Человеческий простат-специфический мембранный антиген (Human prostate-specific membrane antigen, hPSMA)
Мезотелиома	Мезотелин
	Белок активации фибробластов (Fibroblast ac^va^on protein, FAP)
Остеосаркома	Человеческий рецептор эпидермального фактора роста (Human epidermal growth factor receptor, HER2)
	α-цепь рецептора интерлейкина-11 (ИЛ-11)
Рак шейки матки	CD44v7 и CD44v8
Желудочно-кишечные стромальные опухоли	KIT
Рак яичников	Фолатный рецептор-α (Folate receptor-α, FRα)
	Лиганд NKG2D
Опухоли брюшины	MUC16

Продолжение таблицы

Опухоль	Антигены, на которые нацелены CAR
Глиобластома	α2-цепь рецептора интерлейкина-13 (ИЛ-13)
	HER2 и α2-цепь рецептора ИЛ-13
Метастатический почечно-клеточный рак	Карбокси-ангидраза-IX (carboxy-anhydrase-IX, CAIX)
Аденокарцинома поджелудочной железы	Her2/neu и CD24
Рак молочной железы	ErbB2 и MUC1
Метастазирование в печень	Раковый-эмбриональный антиген (Carcinoembryonic antigen, CEA)
Универсальное воздействие	Биотин
	Изотиоцианат флюоресцин (fluorescein isothiocyanate, FITC)
Воздействие на опухолевую сосудистую сеть	VEGFR-2

Ведутся разработки тандемных CAR, внеклеточный домен которых состоит из двух разных scFv. Например, биспецифический тандем CAR — HER2 и α2-цепь рецептора ИЛ-13 демонстрирует дополнительную активацию Т-клеток при встрече с обоими антигенами [12]. A. Bister et al. сообщают о потенциально эффективной комбинации CD5 и CD19 тандемного CAR у пациентов с мантийноклеточной лимфомой. Данная комбинация позволяет уменьшить воздействие на здоровые клетки несущие на себе лишь один из этих рецепторов (« on-target off-tumor » токсичность) [13].

С целью упрощения конструкции разработана концепция универсальных CAR, которые с помощью искусственных молекул-адапто- ров (например, изотиоцианат флюоресцин (fluorescein isothiocyanate, FITC)) распознают альтернативные ТАА, что позволяет «настраивать» активность CAR T-клеток и делает их применение более безопасным [7].

Одна из многообещающих и наиболее распространенных [14] мишеней (57 %) — рецептор CD19, который экспрессируется на большинстве как нормальных, так и опухолевых В-лимфоцитов.

Технологии производства. Существует два возможных способа получения CAR T-клеток: in vivo (in situ) (в кровь пациента вводятся наночастицы, превращающие Т-клетки пациента в CAR T-клетки) и ex vivo (производство состоит из нескольких этапов).

Рис. 3. Способы получения CAR T-клеток [15]

Этапы производства CAR T-клеток ex vivo [16]:

• 1)    лейкоцитаферез;

• 2)    вирусная /невирусная трансдукция с антигеном;

• 3)    культивирование до идеальной дозы от 1 до 5 х 10 8 клеток;

• 4)    контроль продукта (качество, стерильность);

• 5)    подготовка к инфузии.

Клинические исследования . Из экспериментальной технологии лечение онкологических заболеваний CAR T-клетками превращается в быстро развивающийся подход к терапии с более чем 500 зарегистрированными клиническими исследованиями при гематологических новообразованиях и солидных опухолях. При этом большинство из них проводится в США и Китае [17].

Клинические исследования CD19 CAR T-клеток показали эффективность при онкоге-матологических заболеваниях, включая острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) и неходжкинские лимфомы (НХЛ) [18].

Продемонстрирована активность BCMA-CAR T-клеток у пациентов с множественной миеломой (ММ) [19, 20], начаты испытания у пациентов с лимфомой Ходжкина (ЛХ) [21 22]. Продолжаются исследования в области применения CAR T-клеточной терапии при некоторых солидных опухолях (глиобластома, нейробластома, HER2-позитивная саркома) [23–25].

По данным систематизированного обзора и мета-анализа исследований в области CAR T-клеток за период 2008–2017 гг. [26] было опубликовано 60 исследований: 18 исследований (30 %) в области онкологии и 42 исследования в области гематологии (32 % — ОЛЛ 18 % — НХЛ, 3 % — ОМЛ, 2 % — ХЛЛ, 2 % — ЛХ 13 % — пациенты с двумя или более онкогема-тологическими диагнозами). В большинстве (57 %) — это исследования I фазы.

Аутологичные CAR T-клетки. В 2017 году Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) одобрило первые два препарата для CAR T-клеточной терапии: Kimriahтм (tisagenlecleucel CTL019, Novartis) [27] для лечения пациентов до 25 лет с рецидивирующими или рефрактерными (Р/Р) формами пре-В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (пре-В-ОЛЛ) [28] и для лечения взрослых пациентов с Р/Р формами диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (ДКВКЛ) [29] и Yescartaтм (axicabtagene ciloleucel, Kite Pharma/Gilead) [30], для лечения взрослых пациентов с Р/Р формами ДКВКЛ [31]. Оба препарата являются CD19-CAR2-го поколения, с отличием в использованном векторе на этапе производства: лентивирусный вектор — Kimriahтм, ретровирусный — Yescartaтм. Другие CAR T-клетки являются исследовательскими продуктами в рамках международных или локальных клинических испытаний.

По данным многоцентрового исследования Yescartaтм II фазы у взрослых пациентов с рефрактерной формой ДКВКЛ (Zuma 1) частота общего ответа (ЧОО) составила 82 %, полной ремиссии (ПР) — 54 %. За период наблюдения (медиана — 15,4 месяца) у 40 % пациентов ПР сохраняется [32].

В исследовании Kimriahтм II фазы у пациентов с В-ОЛЛ ЧОО составила 81 %, ПР с отсутствием минимальной остаточной болезни (МОБ-негативная) — 60 %, МОБ-негативная ПР с не полностью восстановившимся кроветворением — 21 %. Бессобытийная выживаемость (БСВ) и общая выживаемость (ОВ) на период наблюдения 6 месяцев составили 73 % и 90 % соответственно, а на период 12 месяцев: БСВ — 50 %, а ОВ — 76 % [28].

Рис. 4. Бессобытийная и общая выживаемости у пациентов с В-ОЛЛ при проведении терапии Kimriah ^тм [28]

Побочные эффекты терапии. Лечение онкологических заболеваний без возникновения токсичности и нежелательных явлений — редкость. Аутологичная CAR T-клеточная терапия не исключение,она имеет серьезные побочные эффекты и различный профиль токсичности.

Наиболее распространенными побочными эффектами являются синдром выброса цитокинов («цитокиновый шторм»);

нейротоксичность;

синдром лизиса опухоли;

аллергические реакции;

В-клеточная аплазия.

Рис. 5. Сроки возникновения токсичности [32, 33]

Таблица 2

Частота синдрома выброса цитокинов и нейротоксичности (адаптировано из [34])

Исследование	Продукт	Заболевание	Синдром выброса цитокинов, степень 3/4	Нейро-токсичность, степень 3/4
ZUMA-1	Yescartaтм	ДВККЛ и ПМВКЛ	13 %	28 %
Transcend	Tisangenlecleucel	ДВККЛ	1 %	15 %
Juliet	Kimriahтм	ДВККЛ	22 %	12 %
CRB-401	BB2121	ММ	2 %	<1 %

Синдром выброса цитокинов (СВЦ) — это жизнеугрожающее состояние, основными проявлениями которого являются гипотензия гипоксия, лихорадка и неврологические нарушения. Данное осложнение развивается в период от 1 до 10 дней (медиана — 3 дня) [34]. Факторами риска являются высокая опухолевая нагрузка, наличие активной инфекции на момент начала CAR T-клеточной терапии. Нейротоксичность развивается в течение 8 недель после введения препарата: медиана — 7 дней для пре-В-ОЛЛ и 12 дней для ДКВКЛ [34].

Основные проявления — изменение уровня сознания, галлюцинации, делирий, афазия атаксия, судороги, тремор. В-клеточная аплазия обусловлена деплецией пула нормальных В-лимфоцитов.

Проблемы CAR T-клеточной терапии и пути их преодоления. Возникновение рецидивов заболевания связано со снижением количества CD19 CAR T-клеток в крови пациента, либо обусловлено потерей экспрессии CD19 на поверхности опухолевых клеток.

Потеря эффективности

Потеря CD19 с поверхности клеток ОЛЛ

Потеря CAR-T клеток из крови

CD 19 рецидив

CD19+ рецидив

• •    CAR Т-клеткам требуется более высокая плотность таргетного антигена, чем естественным Т-клеткам.

  Потеря активных CAR Т-клеток связана с их истощением

  
  

• *    Опухолевые клетки имеют низкую плотность CD 19

• •    Данный механизм резистентности «включается» у пациентов с высокой опухолевой нагрузкой

  Е. \Л»л«, 1« European САЯ-I tai m<*1ift£ Рйга 5019

  
  

Рис. 6. Причины потери эффективности CAR T-клеточной терапии (адаптировано из [35])

Как улучшить CAR Т терапию?

Потеря CD19 с поверхности клеток ОЛЛ

Потеря CAR-T клеток из крови

CD19 рецидив

• •    -Двойное таргетирование»: CD19 и CD22

• •    Четвертое поколение CAR Т клеток

• •    Повышение эффективности CAR T клеток с помощью ингибиторов сигнального пути

• Повторная использование таргетирования* • Использование терапии, для истощения

CD19' рецидив

«двойного

комбинированной предотвращения

• Создание гуманизированного scFv против таргетных антигенов.

Е Wck-rg. Iм Етгермп С*ЯТ

Рис. 7. Пути повышения эффективности CAR T-терапии (адаптировано из [35])

Заключение. Адоптивная иммунотерапия с использованием генно-модифицированных Т-лимфоцитов, безусловно, стала прорывным направлением в медицине и квинтэссенцией современной парадигмы онкологии и не только ведет к персонализированной медицине,но и дает надежду на значительное улучшение результатов лечения. Данные биотехнологии требуют высоких материальных (автоматизация технологического процесса), интеллектуальных и организационных ресурсов что предполагает их возможную реализацию (во всяком случае, на первоначальном этапе освоения) лишь в крупных научных центрах. Необходимо повышение как эффективности так и безопасности применения CAR T-клеток. В то же время, предстоит решить один из немаловажных вопросов: управляемость CAR T-клетками во временных, пространственных и функциональных измерениях. Нельзя отрицать, что адоптивная Т-клеточная иммунотерапия обладает потенциально высокой эффективностью. К сожалению, несмотря на то что появление CAR T-клеточной терапии открывает новые возможности лечения пациентов с онкологическими заболеваниями, частота достижения ответа ограничена,а появление рецидивов не редко. В терапии солидных опухолей успехи менее впечатляющие, чем в он-когематологии,что связано с особенностями биологии солидных опухолей и нерешенными вопросами стимулирования инфильтрации и персистирования CAR T-клеток в опухолевом микроокружении. Тем не менее, адоптивная иммунотерапия находится в начале своего пути и, возможно, пришло время для более тщательной оценки способов влияния на иммунную систему, которые позволят повысить эффек- тивность и минимизировать неблагоприятные явления связанные с CAR T-клеточной терапией в будущем. Вероятно, дальнейшие клинические исследования терапии CAR T-клетками будут направлены не столько на преодоление рефрактерности опухоли к стандартным программам лечения,сколько на решение проблемы эрадикации остаточного опухолевого клона на ранних этапах терапии, что откроет перспективы к излечению онкологических заболеваний в условиях реальной клинической практики.