Современные взгляды на проблему консервации донорского материала в эндотелиальной кератопластике (обзор)

Corresponding author — Raisa R. Ibragimova

Тел.: +7 (926) 5408089

более эффективным методом лечения эндотелиальных поражений роговицы. Появление селективных подходов при оперативном вмешательстве привело к разработке новых хирургических методов и таких операций, как DSEK (Descemet’s stripping endothelial keratoplasty) и DMEK (Descemet membrane endothelial keratoplasty), актуальных в настоящее время [1]. Смысл указанных операций заключается в замене внутреннего слоя роговицы, который выполняет насосную и барьерную функции, и его несостоятельность приводит к появлению эндотелиально-эпителиальных дистрофий.

Цель — провести оценку подходов к заготовке донорского трансплантата в эндотелиальной кератопластике, проанализировать преимущества и недостатки каждого из них.

В обзоре представлены работы по задним ке-ратопластикам с предварительно заготовленными трансплантатами современными методами консервации; выборка за последние 16 лет в период с 2006 по 2022 г., публикации доступны к изучению по данным основных научных баз PubMed, eLibrary.ru. В итоговый анализ включены 50 литературных источников.

DSEK или DSAEK (Descemet’s stripping automated endothelial keratoplasty) — суть методик заключается в том, что донорский материал вырезается керато-мом либо фемтосекундным лазером [2–4]. Среди преимуществ можно выделить малую инвазив-ность, предотвращение операции по типу «открытого неба», хорошую выживаемость донорского материала, но следует отметить послеоперационный сдвиг рефракции в сторону гиперметропии и недостаточно удовлетворительные функциональные результаты. Именно поэтому чем толще трансплантат, тем ниже зрительные функции, что привело к популяризации ультратонкого трансплантата DSAEK (<100 мкм) [5, 6], который готовится с помощью микрокератома или лазера. При подготовке лазером трансплантат находится эндотелием наружу, что приводит к потере эндотелиальных клеток (ЭК), а при подготовке микро-кератомом присутствует высокий риск отбраковки материала.

Вершиной кератопластики сегодня является операция DMEK, среди ее достоинств следует отметить минимальный индуцированный астигматизм ввиду отсутствия швов, применения малых разрезов, небольшой объем трансплантируемой ткани, низкий процент реакций отторжения, короткий период реабилитации, повышение безопасности вмешательства, отсутствие необходимости в специальном оборудовании, что экономически выгоднее и т. д. [7–9]. Между тем не стоит забывать, что данная операция является сложнее в техническом исполнении, в частности, ее травматичность на этапе выделения ДМ, высокие риски отбраковки материала, что вынуждает использовать донорский материал с максимально высокой плотностью клеток, что нецелесообразно в условиях высокой потребности в донорском материале. Следует также отметить, что времени, затраченного на выделение ДМ при данной технологии, требуется больше, необходимы более высокие хирургические навыки, чем при использовании других техник. Таким образом, высокий риск отбраковки материала, необходимые навыки и время операции являются серьезными лимитирующими факторами, что создает серьезный барьер для хирургов, которые вынужденно делают выбор в сторону более простой классической операции [10, 11].

В связи с этим в современной эндотелиальной кератопластике в клинической практике стали зарождаться подходы предварительной консервации трансплантатов, суть которых заключалась в дооперационной заготовке и консервации материала для имплантации хирургом или глазным банком [12]. Это позволило сократить время операции, свести к минимуму риск перфорации во время предоперационной подготовки трансплантата, улучшить послеоперационное качество жизни пациента. В ходе данной эволюции глазное банковское сообщество последовательно способствовало принятию новых модификаций эндотелиальной кератопластики, предоставляя ткани, обработанные для конкретного метода пересадки эндотелия, устраняя основные риски потери донорской ткани в операционной и одновременно технически облегчая операцию для хирурга. Примерами этого являются предварительная обработка микрокератомом донорской ткани для DSAEK [13] и в последнее время предварительная загрузка трансплантатов ультратонкого DSAEK в инжектор перед доставкой хирургу [14, 15]. Аналогично обстоит дело касательно техники DMEK с дополнением по предварительной маркировке [16–18].

Подходы к выделению и консервации десце-метовой мембраны. Существуют различные способы подготовки трансплантата для операции, например, в 2013 г. E.A. Groeneveld-van Beek с соавт. предложил использовать технику no-touch (от англ.: бесконтактная) для выделения ДМ [19]. При помощи ножа «хоккейная клюшка» ДМ вместе с трабекулярной сетью по кругу отсепаровывается с корнеосклерального лоскута, затем, полностью отделив от подлежащей стромы, трансплантат окрашивают трипановым синим и помещают на мягкую контактную линзу, где с помощью трепана 9,5 мм высекают слой ДМ с эндотелием, который транспортируют в питательную среду.

М. Muraine и соавт. [20] предложили в 2013 г. технику, при которой сепарацию ДМ с трабекулярной сетью от корнеосклерального лоскута совершают не целиком по кругу, а на 330°, далее раствором BSS производят отделение ДМ от стромы при помощи 27G-канюли. Трансплантат в виде двойной дубли-катуры имплантируется в переднюю камеру реципиента эндотелием, обращенным в просвет передней камеры, то есть в первоначально правильной ориентации, что снижает риск потери эндотелиальных клеток.

При классическом DMEK трансплантат формируется при помощи одной из популярных сегодня методик: SCUBA (submerged cornea using backgrounds away) либо «big bubble» («большой пузырь») [3]. Методика SCUBA заключается в следующем: корнеосклеральный диск, обращенный эндотелием вверх, кладут в высекатель роговицы, ДМ окрашивается раствором трипанового синего (0,06%, Stephens Instruments, Lexington, KY), со стороны эндотелия отделяется его участок заданного диаметра, далее с краев трепанационной насечки пинцетом отсе-паровывается ДМ от стромы, сворачивается в рулон и помещается в картридж для интраокулярной линзы, заполненный вискоэластиком. ДМ вводится в переднюю камеру через тоннельный разрез размером около 3 мм с височной стороны. Ирригацией сбалансированным солевым раствором (BSS, Alcon, Fort Worth, TX) и введением воздуха производится введение, расправление трансплантата в передней камере [21].

Суть методики «big bubble»: отделение ДМ от подлежащей стромы производится путем введения воздуха или жидкости (DMAEK (Descemet membrane automated endothelial keratoplasty) [22], DMEK-S (Des-cemet membrane endothelial keratoplasty with a stromal rim) [23], PDEK (Pre-stripped descemet membrane endothelial keratoplasty) [24]). Размер пузыря при этом составляет приблизительно 6–7 мм. A. Agarwal с со-авт. в 2014 г. вводили воздух в средние слои стромы для формирования пузыря между предесцеметовым слоем (слой Dua) [25–27] и стромой, далее в этот участок вводился раствор красителя, ДМ отсекали ножницами и помещали в раствор для консервации [28]. M. Busin c соавт. в те же года создавали «big bubble» с помощью культуральной среды, которую вводили между ДМ и задними слоями стромы, затем полученный материал консервировали в среде при температуре 31°C в течение 7 дней. После консервации сепарировали ДМ [29, 30]. Проанализировав результаты двух указанных методик, было выявлено, что при методике SCUBA разрыв ДМ составлял 26%, в то время как при «big bubble» — 30%. Снижение плотности эндотелиальных клеток (ПЭК) при методике SCUBA — 26% (12,5-49%), «big bubble» — 23% (15-37%) [31].

В исследованиях результатов трансплантации консервированной ткани донора уменьшение ПЭК за первый месяц после операции была 36-40%, за 3 мес. — 30±20%, за 6 мес. — 32±20%, за 12 мес. — 29-44% и за 24 мес. — 35% [12, 32].

M.A. Wolle и соавт. в 2017 г. исследовали 9 роговиц, предварительно помещенных в modified Jones tube, окрашенных витальным красителем за 24 ч до операции и хранившихся в камере Крольмана (Krolman viewing chamber, Boston, MA). В результате потеря ЭК составила 19%, что незначительно отличалось от контрольной группы, где потеря составила 22% [33]. В отличие от этого K. D. Tran с соавт. обнаружили бóльшую потерю ЭК в modified Jones tube по сравнению с группой с предварительным сохранением в камере Крольмана. Тем не менее обе группы имели клинически приемлемую потерю ЭК [34].

В 2018 г. L. R. Newman с соавт. представила отчет, где по указанному способу было прооперировано 111 глаз с эндотелиальной недостаточностью.

Авторы фиксировали силу скручивания трансплантата, время разворачивания и центрирования ткани (таймер запускался в момент введения ткани и останавливался, когда помещался последний пузырек газа), частоту послеоперационных «ребаблов» (дополнительного введения воздуха) и частоту неудачных трансплантаций. ПЭК измерялась через 3 и 6 мес. По результатам было отмечено, что все ткани оставались хорошо окрашенными и легко визуализировались на момент операции ( n =111). Средняя сила скручивания составила 2,2 (диапазон: 1–4). Среднее время центрирования и разворачивания ткани составило 3,5 мин (диапазон: 0,5–11,25 мин), что несколько меньше, чем было опубликовано в аналогичных методиках разворачивания эндотелия (приблизительно 5–6 мин) [36]. Первичного отторжения трансплантата не было. В 16 (14,4%) случаях после операции требовался «ребабл». Из этих 16 случаев в 2 потребовалось ввести воздух еще один раз. В 10 из 111 случаев (9%) прокрученная донорская ткань прилипла к стенке стеклянной трубки и потребовалось орошение внутри трубки с помощью BSS на канюле, чтобы освободить ткань для инъекции. Потеря ЭК через 3 и 6 мес. после операции составила 26,7% ( n =63 глаза) и 30,9% ( n =67 глаз), соответственно. Пациентов наблюдали через 1 день, 1 нед., 1, 3 и 6 мес. после операции. По итогу время операции и риск повреждения донорской ткани при использовании предварительно загруженной ткани оказался ниже [16].

В 2019 г. J. Hooton с соавт. сообщили о результатах серии исследований 33 кадаверных глаз с эндотелиальной дистрофией Фукса, которые были предварительно очищены, окрашены и загружены в Straiko modified Jones tube (p3DMEK — prestripped, prestained, and preloaded Descemet membrane endothelial keratoplasty) в глазном банке (Ever-sight, Ann Arbor, MI), критериями исключения являлись глаза от больных диабетом. Целью исследования являлось определение безопасности длительного хранения и транспортировки трансплантатов. Роговицы были рандомно разделены на три группы, которые подготовлены за 9 ч (контроль), 48 и 72 ч до разгрузки и анализа. Контрольная группа (менее 9 ч хранения) состояла из тканей, упакованных в холодильник (24 ч) и доставленных автомобилем непосредственно в глазной центр Келлога в Ann Arbor, штат Мичиган, в те же дни, когда они были подготовлены. Для группы длительного хранения 1 (48 ч хранения) ткани были упакованы в 24-часовой холодильник и отправлены в глазной банк в Кливленде, штат Огайо, воздушным транспортом. Лед заменялся, и ткани переупаковывались в новую транспортную коробку. Затем они были отправлены обратно в глазной банк в Ann Arbor, для доставки на следующий день. Затем ткани были доставлены автомобилем в глазной центр Келлога. Группа длительного хранения 2 (72 ч хранения) состояла из тканей, которые были упакованы в 24-часовой холодильник и отправлены в глазной банк в Чикаго, штат Иллинойс, через Федеральный экспресс. Затем они были переупакованы и отправлены для доставки на следующий день в глазной банк в Кливленде. Наконец, ткани переупаковывались в третий раз и отправлялись обратно в глазной банк в Ann Arbor, для доставки на следующий день. Затем ткани были доставлены автомобилем в глазной центр Келлога. Таким образом имитировалась внутренняя и международная транспортировка. Затем роговицы окрашивали с помощью витального красителя Calcein — AM (Molecular Probes, Eugene, OR) и визуализировали с помощью инвертированного конфокального микроскопа. Оценивали потерю ПЭК и устойчивость окрашивания. Для количественной оценки ПЭК использовалось программное обеспечение MetaMorph (Molecular Devices, Downingtown, PA), а окрашивание оценивалось субъективно «все или ничего». По результатам не было отмечено статистически значимой разницы в ПЭК для контрольной, 48- и 72-часовой групп, которые составили 25,1±8,8, 26,4±17,5 и 19,2±11,5% соответственно (P =0,45; тест Kruskal — Wallis). Во всех тканях каждой группы не было выявлено потери окрашивания в каждой временной точке анализа. ПЭК в тканях P3DMEK, подготовленных за 48 и 72 ч и доставленных с использованием стандартных методов, аналогична таковой в тканях p3DMEK, подготовленных в тот же день. Эти результаты подтверждают безопасность внутренних и международных транспортировок трансплантатов p3DMEK [37].

S. Solar и соавт. в 2020 г. [38] провели исследование, основанное на исследованиях M. Busin [30] 2016 г., на 10 донорских трансплантатах. Возраст доноров составлял от 57 до 72 лет. Трансплантаты были срезаны 8 мм трепаном и окрашены 0,06%-м трипановым синим в течение 3 мин перед помещением в среду Optisol-GS в виде свободно плавающих спиралей. После помещения трансплантатов в чашку Петри каждый трансплантат был индивидуально сложен втрое с помощью микропинцета и хранился внутри исследуемого картриджа Treyetech DMEK (Treyetech, Baltimore, MD) в холодильнике при 4°C в среде Optisol-GS в течение 48 ч. Затем их нагревали до комнатной температуры во время исследования в течение 30 мин и помещали в чашку Петри, заполненную BSS, далее трансплантат извлекали микропинцетом из раствора, где он естественным образом превращался в спираль. Приведенные данные свидетельствуют о наличии своего рода памяти у трансплантатов DMEK, когда они складываются в конфигурацию, противоположную направлению прокручивания. Авторы продемонстрировали то, что предварительная загрузка трансплантата таким образом приводит к менее плотной прокрутке ткани в течение 2-минутного периода, но стоит отметить малый размер выборки. Исследователи не оценивали ПЭК, поскольку предыдущие исследования показали отсутствие связи с тенденцией к прокручиванию при DMEK [38], также остается открытым вопрос о 24 и 96 ч хранения трансплантатов в таком варианте.

В сравнительном исследовании 2020 г. во главе с A. Rickmann не было обнаружено существенной разницы в потере ЭК в трансплантатах ДМ, загруженных на 48 ч в новый транспортный картридж Geuder (Heidelberg, Germany) и трансплантатами, оставленными на строме, хранящимися в камере Крольмана. В обеих группах потерю ЭК также была очень низкой, что авторы связывали с используемой техникой подготовки. В предыдущих исследованиях использовали ручной способ отслаивания ДМ, в то время как в данном исследовании пользовались методикой «no-touch» с пузырьками жидкости, описанная выше. Новый транспортный картридж имеет те же характеристики, что и коммерчески доступный картридж из боросиликатного стекла (Geuder DMEK), но на 50% больше по объему и включает две проницаемые для жидкости пробки, которые обеспечивают конвекцию среды и, таким образом, промывают трансплантат свежей средой во время транспортировки. Картридж из боросиликатного стекла уже доказал свою безопасность и эффективность в клинической практике. Этот картридж имеет более гладкую внутреннюю поверхность, чем пластиковый инжектор для имплантации интраокулярной линзы, что позволяет бесконтактную загрузку и имплантацию без астигматизма через прозрачный туннель роговицы диаметром 1,6 мм [39].

E. Yourek и соавт. смогли исключить большую потерю эндотелиальных клеток при использовании инжекторов меньшего размера — 0,5–1,4 мм [40]. К недостаткам старых версий картриджей также включают прямой контакт при введении трансплантата щипцами, возможные острые края и шероховатую поверхность пластиковых картриджей. Это особенно актуально, поскольку трансплантаты сворачиваются эндотелием наружу. Хотя стоит отметить, что у итальянских и британских ученых в сравнительном исследовании, проведенном в 2016 г., разница между группами «эндотелием — наружу» и «эндотелием — внутрь» по потере ЭК была статистически незначима. Потеря эндотелиальных клеток после имплантации составила 10,53% (±2,82) при эндотелии внутрь ( n =9) по сравнению с 7,56% (±14,74) при эндотелии наружу ( n =9) (p> 0,05). Время подготовки и раскладывания составило 4,43 мин (±3,43) и 0,96 мин (±1,10) при эндотелии внутрь по сравнению с 1,68 мин (±0,57) и 4,92 мин (±4,21) при эндотелии наружу. Наблюдалась статистическая значимость между эндотелием внутрь и эндотелием наружу для времени загрузки ( p =0,04) и разворачивания ( p =0,023) [41]. Кроме того, старые картриджи могут не обеспечивать непрерывную конвекцию среды вокруг трансплантата и обычно по этому поводу используют плунжер, что приводит к прямому контакту с трансплантатом [42, 43]. В исследовании A. Rickmann и соавт. не смогли обнаружить каких-либо смещений трансплантата во время транспортировки, а потеря эндотелиальных клеток после инъекции из транспортного картриджа была сопоставима с обычной группой. Также следует отметить факт, что использовалась декстран-содержащая среда, позволяющая сохранять жизнеспособный эндотелий при комнатной температуре в течение 4 дней [39, 40], по некоторым данным превосходящая трансплантаты, хранившиеся в среде Optisol-GS [44]. Ограничением данного исследования является небольшое количество донорских роговиц, использованных для изучения различий в потере ЭК между группами. Вместе с тем для исследования использовались роговицы с несколько более низким исходным количеством эндотелиальных клеток, чем роговицы, предназначенные для трансплантации. Это могло повлиять на смертность клеток, хотя различий между группами не было. В целом в этом доказательном исследовании авторы смогли показать, что предварительно срезанные трансплантаты DMEK могут быть загружены в новый транспортный картридж храниться и транспортироваться до 2 дней без потери качества по сравнению с обычными предварительно срезанными трансплантатами DMEK в камере Крольмана.

В нескольких исследованиях [45, 46] было показано, что подготовка донорских тканей за 2 дня до операции не оказывает негативного влияния на прикрепление трансплантата или выживаемость эндотелиальных клеток. Кроме того, было показано, что предварительно отделенные и отправленные трансплантаты DMEK, подготовленные в глазном банке Соединенных Штатов Америки, при трансплантации достигли клинических результатов, сопоставимых с трансплантатами, подготовленными хирургом непосредственно перед операцией.

Использование готовых, загруженных в картридж трансплантатов, свернутых эндотелием внутрь, устраняет необходимость подготовки и манипуляций с ними перед имплантацией, такой метод защищает эндотелий от контакта со стенками картриджа и, по мнению авторов, снижает силу скручивания трансплантата, делая тем самым хирургическое вмешательство более простым, что может оказать положительное влияние на механическое напряжение, потерю эндотелиальных клеток и предотвращение разрывов. Эти факторы имеют решающее значение для долгосрочного выживания трансплантата [40, 47].

Однако у такого подхода имеются и свои минусы: в частности, хирург не может моделировать необходимый размер трансплантата, выбирать способ имплантации и конфигурацию «свертка» ДМ, а также способ окрашивания и установки метки для определения правильной стороны [48]. К тому же это значительно увеличивает финансовую составляющую, так как требует специальных одноразовых картриджей для хранения и имплантации ДМ и наличие дополнительных специалистов, хорошо владеющих техникой выделения ДМ.

В настоящий момент заготовку трансплантатов для DMEK по запросу хирурга по всему миру осуществляют несколько глазных банков [8, 49]. Что касается России, то практика консервации чистой ДМ отсутствует, и сегодня действующие глазные банки Российской Федерации не предоставляют такой возможности: только несколько глазных банков, в их числе «Айлаб» и «Тканевой глазной банк МНТК» [50], изготавливают и доставляют хирургам консервированные ультратонкие трансплантаты роговицы для ультратонкого DSEK. Вследствие этого проблема актуальна, особенно в нашей стране, и требует разработки альтернативных методик для большего внедрения технологии DMEK. С разработками, произведенными в научно-исследовательском институте глазных болезней, можно будет ознакомиться в наших последующих работах.

Заключение. В настоящем обзоре проведен анализ литературы современных отечественных и зарубежных методов выделения и консервации ДМ, выявлены факторы, определяющие качество зрения после эндотелиальной кератопластики с предварительной консервацией, которые помогут стимулировать дальнейшее развитие послойных пересадок, оптимизируя результаты оперативных вмешательств, повысить удовлетворенность пациентов результатами операции, обеспечить доступность, длительное хранение донорских трансплантатов, сократить время оперативного вмешательства, облегчить задачу начинающим хирургам, одновременно повышая хирургическую эффективность и безопасность.