Создание биополимерных матриц для регенеративного тканегенеза

Одной из тенденций современной медицины является активное внедрение биологических полимеров, способных длительно выполнять необходимые функции или разлагаться на простые метаболиты и выводиться организмом за установленный срок без вреда для человека, что зачастую сопровождается образованием новых тканей. Глобальное старение населения и растущее число хирургических вмешательств для замены тканей и органов создают основу для устойчивого долгосрочного роста спроса на биосовместимые и биодеградируемые медицинские материалы [4]. Важнейшее и быстро развивающееся направление современной регенеративной медицины — применение клеточных технологий, например, в лечении острых и хронических ран, диабетических язв, ожогов. Задача клеточных технологий в этом случае заключается не только в трансплантации живых клеток в область дефекта, но и в полном восстановлении структуры и функции кожного покрова, в стимуляции регенеративных процессов и создании микроокружения для реализации потенциала собственных тканей и клеток. Для решения таких задач используют методы тканевой инженерии [8]. Тканевая инженерия призвана решить многие задачи регенеративной медицины, которая рассматривает вопросы улучшения продолжительности и качества жизни человека за счет восстановления утраченных структур и функций органов и тканей. Перспективным способом лечения и восстановления тканей может быть применение новых материалов, как на основе клеточных технологий, так и биодеградируемых матриц [2, 3, 5, 6].

Нами предлагается наряду с консервативными методами лечения заместительная терапия при помощи трехмерных матриксов, гистотипически подобных тканям организма, с биологически активными агентами: клеточными производными — коллагенами и ламининами, способствующими структурообразовательной функции поврежденной области.

Материалы и методы

Исследования проведены на 50 инбредных лабораторных крысах-самцах массой 250±10,5 г. (ЦКП «Виварий конвенциональных животных» ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). Содержание, кормление, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществлялся в соответствии со строгим соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986) и согласно правилам лабораторной практики Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г.) в условиях вивария ИОЭБ СО РАН (г. Улан-Удэ). Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1977). Проведено 2 блока исследований. Первый блок исследованийв стерильных условиях (БМБ-II, «Ламинарные системы», Россия) включал: экстрагирование раствора коллагена I типа из сухожилий хвоста крыс 0,1% раствором уксусной кислоты (Лабтех, Россия), подбор условий полимеризации раствора коллагена в гелевую матрицу (1–5 мг/мл); оптимизацию условий культивирования иммортализованныхкератиноцитов кожи человека линии HaCaT на коллагеновых матрицах (+37 ⁰С, 5% CO 2 (С-150, Binder, Германия), среда ДМЕМ с глутамином, 10% ФБС (ПанЭко, Россия), 10–40 тыс. клеток на см²); децеллюлирование трехмерной коллаген-ламининовой матрицы (EDTA; 0,1%TritonX-100, Sigma-Aldrich, США).

В ходе второго блока исследований с помощью гистологических и иммуногистохимических методов (первичные антитела на коллаген Iтипа, ламинин, панцитокератин, вторичные антитела с флуорохромом Alexa488; DAPI, VectaShield, VectorLab, США; флуоресцентная фотомикроскопия– EvosFLCellIS, ThermoFisherSc., США) была проведена идентификация мат-риксных компонентов и оценка эффективности ранозаживления in vivo на моделях раневого дефекта кожного покрова у лабораторных живот-ных(лоскутные полнослойные кожные раны площадью — 900 мм² на выбритом от шерсти участке спины при подкожном введении 250 мг/кг хлоралгидрата и наложении швов по периметру раны для вторичного натяжения).Для забора материала животных выводили из эксперимента на 4, 7, 14, 21 сутки для оценки особенностей репаративной регенерации в различные фазы раневого процесса(общий наркоз, декапитация) в трех опытных группах (1 — группа животных, которым на рану через 24 часа наносилась коллагенламининовая пленка; 2 — группа животных, которым на рану через 24 часа накладывалась желатиновая гемостатическая губка (Spongostan, Ferrosan, Дания); 3 — группа животных, на раны, которым не привносился ранозаживляющий материал; 4 — группа животных, не получавших каких-либо воздействий).

Полученный материал раневой поверхности кожного покрова фиксировался в 10%-ном формалине с последующим обезвоживанием с касторовым маслом, заливкой в парафин и окраской гематоксилином и эозином (БиоВит-рум, Россия) срезов, подготовленных на ротационном микротоме (SRM200, Sakura, Япония).

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования in vitro позволили с помощью клеточных технологий и применения биполимерного субстрата получить данные о возможности образования устойчивой тканеинженерной гистотипической композиции на основе экстрагированного в виде гелевой пленки коллагеновой матрицы с децеллюлированной ламининовой поверхностью (фото 1, 2). Иммуногистохимический флуоресцентный анализ идентифицировал экспрессию композитных белков — коллагена I типа и ламинина, а также панцито-кератина — маркера эпителиальных клеток (фото 3).

Таким образом, предлагаемый вариант трехмерной матрицы представляет собой белковую композицию, состоящую из двух основных компонентов, — коллагена первого типа и ламинина базальной мембраны, находящихся в полном гистотипическом подобии со строением кожи человека. Семейства белков коллагенов и ламининов являются двумя самыми распространёнными типами белков кожного покрова человека. Коллаген является основой мезенхимного компонента дермы кожи, обеспечивая ее механическую прочность и упругость. Ламинин является основой любых базальных мембран органов, в том числе и базальной мембраны кожи [1, 7].

Контролируемые исследования динамики течения моделируемого раневого процесса в течение 21 суток показали преобладание клеток воспалительного или пролиферативного ряда и особенности клеточных диффероновв зависимости от фазы раневого процесса.

У животных 1, 2, 3 групп через сутки после моделирования кожной раны при макросъемке отмечали повреждение эпидермиса, дефект был заполнен некротизированными массами. С помощью гистологических методов в области дермы, образующей края и дно раны, наблюдали выраженную лейкоцитарную инфильтрацию; между волокнами отмечали явления отека. Сосуды дермы выявляли популяцию дегранулированных тучных клеток, расширенные сосуды дермы, с выраженным стазом эритроцитов. Результаты исследований, полученные на модели лоскутной кожно-мышечной раны, свидетельствуют о том, что в группах с применением коллаген-ламининовой матрицы на 7, 14 сутки ускорялась динамика сокращения площади раневых дефектов. Рост грануляционной ткани наблюдали со дна раны, в новообразованиях соединительной ткани отмечали васкуляризацию.

Во 2 группе отмечали развитие грануляционной ткани, начало эпителиза-ции раневого дефекта. В этот период исследования у животных 3 группы раневая поверхность была покрыта струпом в виде тонкого пласта, часто фрагментированным, рыхло спаянным с подлежащими тканями. При анализе внешнего состояния раневых дефектов и по данным гистологического анализа на 21 сутки у животных 1 группы отмечали закрытие раны, эпителизацию с краев. У животных 2 группы толщина эпидермиса приближалась к уровню интактного, но преобладали раны, в которых эпидермис не полностью восстановил дефект. В 3 группе наблюдали, что целостность кожных покровов частично не восстановлена, направление и толщина коллагеновых волокон отличались разнообразием — это указывает на незрелость тканей [1]. В глубине дермы отмечали очаги инфильтрации клетками воспалительного ряда.

Полученные данные по восстановлению целостности кожного покрова свидетельствуют о том, что созданная репаративная композиция обладает высокой эффективностью ранозаживления, благодаря направленному росту регенерирующей ткани с поддержанием процессов васкуляризации. Разработанный биосовместимый коллаген-ламининовый ранозаживляющий материал, основанный на комбинации полимерной подложки и продукта синтеза кератиноцитов человека, при этом лишенный клеточной составляющей, отличается сравнительной простотой изготовления, длительностью срока хранения, что позволяет рекомендовать конструкцию к внедрению.