Создание трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

Достижения молекулярной биологии и экспериментальной эмбриологии послужили основанием для создания трансгенных животных, продуцирующих с молоком новые продукты, главным образом рекомбинантные белки медицинского назначения (1, 2). Наряду с изменением состава молока трансгенная технология может быть использована и для других целей: повышение скорости роста, эффективности использования корма и изменение состава туши сельскохозяйственных животных, увеличение скорости формирования и повышения качества шерсти (3, 4). Предприняты обнадеживающие попытки получения трансгенных свиней в качестве источников органов для пересадки человеку (5, 6).

Человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (чГКСФ) является гематопоэтическим фактором роста, который стимулирует главным образом пролиферацию и дифференциацию предшественников клеток гранулоцит-нейтрофильной линии при функционировании зрелых нейтрофилов. После того как гликолизированная форма чГКСФ была выделена из культуры клеток золотого хомячка (7), а негликолизированная форма — из клеток E. coli (8), появилась возможность использовать этот фактор для лечения различных форм нейтропии, лейкопении, вызванной химиотерапией, а также для мобилизации клеток-предшест-венников при трансплантации костного мозга (8). По производству гематопоэтических факторов роста с использованием трансгенных животных имеются лишь единичные сообщения (9, 10).

Единственным успешным методом для создания трансгенных животных были микроинъекции ДНК в пронуклеус оплодотворенных ооцитов. Несмотря на надежность этого метода, его эффективность остается очень низкой: одно трансгенное животное на 40 (у мышей) — 1600 (у крупного рогатого скота) инъецированных яйцеклеток (Eystone, 1999). Затраты на производство одного трансгенного животного методом инъекций ДНК составляют для мышей, свиней, овец и крупного рогатого скота соответственно 120, 25000, 60000 и 546000 долларов США (11). Поэтому практическое получение трансгенных коров посредством микроинъекции гена в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки может осуществляться только на основе использования оплодотворенных in vitro эмбрионов, что на 50-60 % уменьшает затраты. Это обусловлено тем, что получение ооцитов коров на мясокомбинате сокращает до минимума их стоимость по сравнению с хирургическим извлечением созревших или оплодотворенных in vivo яйцеклеток.

В связи с низкой эффективностью получения трансгенных особей и как следствие их высокой стоимостью исследования были направлены на разработку альтернативных методов повышения эффективности создания трансгенных сельскохозяйственных животных. Эти методы включают пересадку ДНК посредством трансфеци-рования спермы (Cappello с соавт., 2000; Shemesh с соавт., 2000), использование рет- ровирусных векторов при инъекции или трансфекции в ооциты или эмбрионы (Chan с соавт., 1998), пересадку генетически трансформированных соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки (Cibelli с соавт., 1998; Baguisi с соавт., 1999; Zakhart-chenko с соавт., 2001), применение трансфецированных примордиальных клеток при создании трансгенных птиц (Vick с соавт., 1993; Watanabe с соавт., 1994).

Большинство методов пока не позволяет получать надежную интеграцию и экспрессию гена и передачу его в последующих поколениях. Метод пересадки трансформированных соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки, хотя и надежен, по сложности не уступает методу микроинъекции гена в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки.

Целью нашей работы было получение трансгенных кроликов, продуцирующих рекомбинантный белок с молоком, посредством пересадки гена в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки.

Методика . Наиболее удачными объектами для производства рекомбинантных белков с молоком являются жвачные животные, а именно козы, овцы и коровы (12, 13). Свиньи рассматриваются также в качестве живого ферментера, хотя сбор молока у них осуществляется значительно сложнее, чем у жвачных (14). Кролик был выбран нами как объект исследований потому, что характеризуется высокой способностью к быстрому размножению и, кроме того, является хорошим кандидатом для производства рекомбинантных белков с молоком в количествах, не превышающих 1 кг в год. В качестве рекомбинантного белка, выделяемого с молоком, служил чГКСФ, применяемый главным образом в онкологии после химио- и радиотерапии (доза на один курс лечения составляет около 5 мг). Производство 1 кг этого препарата может обеспечить лечение ~ 200 тыс. онкологических больных.

Для переноса гена мы применили генную конструкцию чГКСФ с промотором гена лактоглобулина быка, в качестве доноров зигот — половозрелых кроликов в возрасте 5-7 мес и старше. Для стимуляции суперовуляции у кроликов-доноров применяли гонадотропин сыворотки жеребых кобыл — сергон (Чехия). Каждому донору внутримышечно инъецировали по 100 ME сергона, через 48-72 ч самку спаривали с самцом и вызывали овуляцию посредством внутримышечного введения хорионического гонадотропина в дозе 200 МЕ. Через 18-20 ч после спаривания или после убоя животного хирургическим методом извлекали зиготы. После вымывания зигот поиск оплодотворенных яйцеклеток осуществляли под бинокулярной лупой «Nicon» при увеличении х 400. В один из пронуклеусов зиготы инъецировали 1-2 пкл ДНК, затем инкубировали 30-60 мин, с тем чтобы выявить поврежденные клетки. Зиготы, имеющие нормальный внешний вид, пересаживали кроликам-реципиентам, у которых половой цикл синхронизировали с циклом доноров. Самок-реципиентов спаривали с вазэктомированным самцом и вводили хорионический гонадотропин в то же время, когда самку-донора спаривали с полноценным самцом. Эмбрионы трансплантировали в яйцеводы самок-реципиентов хирургическим способом. Через воронку яйцевода вводили катетер, содержащий манипуляционную среду с зиготами. Каждому реципиенту пересаживали 15-20 зигот, распределяя их поровну между яйцеводами. Через 57 сут после окрола всех крольчат метили и одновременно брали образцы ткани уха для анализа ДНК на интеграцию трансгена, которую оценивали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Влияние введения генной конструкции на развитие кроличьих эмбрионов исследовали in vitro до стадии бластоцисты и in vivo у животных-реципиентов до стадии имплантации и рождения потомства. Экспрессию трансгена оценивали по концентрации чГКСФ в молоке с помощью ферментного иммуносорбентного метода (ELISA), применяя два вида специфических антител к чГКСФ. При проведении анализа использовали набор реагентов Pro Con GCSF (ООО «Протеиновый контур», С.-Петербург).

Результаты . При культивировании in vitro микроинъецированные зиготы по сравнению с интактными развивались до стадии бластоцисты примерно одинаково: 27 (77,1 %) из 38 интактных и 48 (78,7 %) из 61 микроинъецированных зигот.

1. Эмбриональные потери микроинъецированных зигот кроликов в процессе беременности

Показатель	Число самок-реципиентов	Из них беременных	Число трансплантированных зигот	Из них развившихся
		гол.     %		гол.          %

Имплантация зигот               4           3     75,0             46                14          30,4

Рождение потомства             14          10     71,4            212                37           17,5

В группе из четырех реципиентов сукрольными оказались три (75,0 %). Из 46 микроинъецированных и трансплантированных зигот до 13 сут беременности отмечено развитие 14 эмбрионов (табл. 1). Отсюда можно заключить, что до периода имплантации развиваются 30,4 % зигот от числа трансплантированных. В следующей группе у 10 (71,4 %) из 14 реципиентов беременность завершилась рождением потомства, причем из 212 проинъецированных и трансплантированных зигот было получено 37 крольчат (17,5 %). Следовательно, из числа микроинъецированных 78,7 % зигот развивались in vitro до стадии бластоцисты, а из числа микроинъецированных и пересаженных 30,4 % зигот — до стадии имплантации и 17,5 % — до рождения по- томства.

Можно предположить, что потери микроинъецированных зигот в процессе культивирования до стадии бластоцисты in vitro составляли 21,3 %, а потери в организме матери к числу микроинъецированных зигот до стадии имплантации — 59,6 % и до рождения потомства — 82,5 %, или 22,9 % с периода имплантации до рождения потомства. Следовательно, основная масса микроинъецированных зигот погибала в первой половине беременности.

С целью получения трансгенных особей с геном чГКСФ 2741 микроинъеци-рованная зигота была пересажена 168 самкам-реципиентам, 116 из которых (69,0 %)

оказались беременными по результатам окрола. Получено 516 потомков, 17 из рых оказались трансгенными, то есть 18,2 % из числа микроинъецированных развивались до рождения потомства и лишь 3,3 % из полученных крольчат трансгенными. При этом доля живых трансгенных особей (8 гол.) составляла кото-зигот были лишь

1,5 % от числа живых родившихся крольчат; возраста половозрелости из них достигли четыре самца. Для размножения трансгенных животных всех исходных трансгенных самцов спаривали с нетрансгенными самками (табл. 2).

2. Оценка эффективности размножения исходных трансгенных кроликов с геном человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

Номер трансгенного самца	Число осемененных самок	Из них окроли-лось
		гол.	%
25	54	36	66,7
512	14	14	100
506	26	25	96,1
505	37	27	73,0
Всего	131	102	77,9

Оплодотворяющая способность трансгенных кроликов после первого осеменения по результатам окрола была достаточно высокой — в среднем 77,9 % (102 самки из 131). Вместе с тем у исходных трансгенных самцов наблюдались значительные индивидуальные различия по оплодотворяющей способности: у двух самцов — 96,1-100 %, у двух других — на 30 % ниже.

Наследование чужеродного гена у исходных трансгенных кроликов в F1 составляло в среднем 16,6 %:

Номер исходного	Число потомков F 1	Из них трансгенных
трансгенного самца		гол.	%
25	154	34	22,1
512	96	9	9,3
506	170	37	21,8
505	205	23	11,2
Всего	625	103	16,6

Этот показатель примерно в 3 раза ниже по сравнению с теоретически возможным по закону Менделя. Низкий уровень наследования чужеродного гена в F1 можно объяснить мозаицизмом исходных трансгенных особей (не все их сперматозоиды были трансгенными), что является обычным явлением при микроинъекции гена в пронуклеус зиготы. У трансгенных кроликов F1 мозаицизм отсутствовал, поэтому представляло интерес оценить наследуемость чужеродного гена в F2 и эффективность размножения трансгенных как самцов, так и самок F1, для чего их спаривали с половозрелыми нетрансгенными особями (табл. 3).

3. Оценка воспроизводительной способности трансгенных кроликов F1

Номер исходного трансгенного самца	Число половозрелых кроликов F 1 , полученных от трансгенных самцов		Из них получен приплод
			a		9
	a          1	9	гол.	%	гол.	%
512	4	3	4	100	3	100
25	5	11	5	100	1	9
505	3	7	3	100	0	0
506	6	4	5	83	0	0

Почти у всех трансгенных самцов F 1 отмечена нормальная оплодотворяющая способность, исключение составлял один трансгенный самец F 1 (получен от исходного самца ¹ 506), который после многократного спаривания с нетрансгенными половозрелыми самками не дал приплода. Нормальная воспроизводительная способность выявлена только у трансгенных самок F₁, полученных от исходного трансгенного самца ¹ 512; от остальных самцов (¹¹ 25, 505 и 506) не удалось получить в F₁ трансгенных самок, способных к воспроизводству, за исключением одной, от которой получен один приплод. Повторные многократные спаривания этой самки с нетрансгенными половозрелыми самцами оказались безрезультатными: все трансгенные самки F 1 , полученные от этих исходных самцов, плодотворно осеменялись только после многократных спариваний, но ни одна не принесла живого приплода. Как правило, в конце беременности плоды погибали или рождались мертвыми, а самки погибали либо в конце беременности, либо вскоре после родов.

Потери воспроизводительной способности и снижение жизнеспособности самок — потомков трех исходных самцов можно, по-видимому, объяснить неадек- ватным местом введения чужеродного гена в геном исходных трансгенных животных.

В связи с тем, что нормальной воспроизводительной способностью обладали самки F₁ при скрещивании только с самцом ¹ 512, его использовали при оценке эффективности наследования гена чГКСФ в F 2 (табл. 4).

Наследование чужеродного гена чГКСФ в F 2 составило в среднем 35 %, причем у потомков, полученных от трансгенных самцов F 1 , этот показатель был несколько ниже, чем у таковых, полученных от трансгенных самок F 2 . Эта разница обу-

4. Оценка наследования гена человеческого гранулоцитарного    колониестимулирующего фактора у кроликов F2, полученных от исходного трансгенного самца ¹ 512

Номер трансгенного родителя	Пол родителя	Получено потомков в F 2 , гол.	Из них трансгенных
			гол.	%
616	a	31	10	32,2
640	a	131	44	33,6
575	a	17	3	17,6
212	a	66	23	34,8
Итого		245	80	32,6
628	9	18	2	11,1
565	9	27	14	51,8
577	9	24	14	58,3
Итого		69	30	43,5
Всего		314	110	35,0

словлена прежде всего тем, что трансгенные родители F 1 в отличие от исходных трансгенных животных не могли быть мозаиками. Эффективность наследования чужеродного гена у потомков F₂ от двух из трех самок F₁ была выше 50 %. Для окончательного суждения о закономерности наследования чужеродного ге-на, по-видимому, необходимо накопление дополнительного материала.

Для определения эффективности наследования чГКСФ в последующих поколениях мы провели спаривание трансгенных са- мок и самцов F2: от 21 окролившейся самки было получено 102 крольчонка (по 4,86 на одну самку). Интеграция гена выявлена у 60 из 102 крольчат, что составляет 58,8 % (у потомков F1 — 16,5 %; у кроликов F2, полученных от трансгенных особей F1, — 36,6 %). Более высокий показатель интеграции гена у кроликов F3 (79,5 %) отмечен после спаривания трансгенных самок с трансгенными самцами. Эти показатели приближаются к теоретически ожидаемым (75 % по закону Менделя). В этом случае среди трансгенных особей должно быть 50 % гетерозигот и 25 % — гомозигот.

У трех трансгенных крольчих мы проанализировали концентрацию чГКСФ в молоке, которая в среднем существенно варьировала — от 8,80 до 22,03 мг/л.

Таким образом, выявленная нами концентрация чГКСФ в молоке трансгенных кроликов дает основание считать ее достаточной для использования этих животных в фармацевтическом производстве. Поскольку для проведения одного курса лечения онкологических больных требуется 5 мг чГКСФ, 1 л молока достаточно для проведения четырех таких курсов. Следовательно, полученные нами линии кроликов, трансгенных по гену человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора под контролем промотора гена β -лактоглобулина быка, могут обеспечить годовую потребность 100 тыс. больных этой категории.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    G o r d o n K., L e e E., V i t a l e J.A. e.a. Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk. Bio/Technology, 1987, 5: 1183-1187.

• 2.    S i m o n s J.P., W i l m u t I., C l a r k A.J. e.a. Gene transfer into sheep. Bio/Technology, 1988, 6: 179

• 3.   P u r s e l V.G., R e x r o a d C.E. Jr. Status of research with transgenic farm animals. J. Anim. Sci., 1993,

• 4.    B a w d e n C.S., S i v a p r a s a d A.V., V e r m a P.J. e.a. Expression of bacterial cysteine biosynthesis genes in transgenic mice and sheep. Transgenic Res., 1995, 4: 87-91.

• 5.    R o s e n g a r d A.M., G a r y N., H o r s l e y J. e.a. Endothelial expression of human decay accelerating factor in transgenic pig tissue: a potential approach for human complement inactivation in discordant xenografts. Transplant. Proc., 1995, 27: 326-341.

• 6.    Y a n n o u t s o s N., L a n g f o r d G.A., C o z z i E. e.a. Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation. Transplant. Proc., 1995, 27: 324-329.

• 7.    K u b o t a N., O r i t a T., H a t t o r i K. e.a. Structural characterization of natural and recombinant human granulocyte colony-stimulating factors. J. Biochem., 1990, 107: 486-492.

• 8.   F r a m p t o n J.E., L e e C.R., F a u l d s D. Filgrastim a review of its pharmacological properties and

  therapeutic efficacy in neutropenia. Drugs, 1994, 48: 731-760.

• 9.   К о J.Ho., L e e C.-S., K i m K.H. e.a. Production of biologically active human granulocyte colony stimu

  lating factor in the milk of transgenic goat. Transgenic Res., 2000, 9: 215-222.

• 10.    U u s i - O u k a r i M., H y t t i n e n J.M., K o r h o n e n V.P. e.a. Bovine α sl -casein gene seguences direct high level expression of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the milk of transgenic mice. Transgenic Res., 1997, 6: 75-84.

• 11.    W a l l R.J., H a w k H.W. Making transgenic livestok. Genetic Engeering on a Large Scale. J. Cellular Biochemistry, 1992, 49: 113-120.

• 12.    E b e r t K.M., S e l g r a t h J.P., T u l l i o P.D. e.a. Transgenic production of a variant of human tissuetype plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression. Bio/Technology, 1991, 9: 835-839.

• 13.    W r i g h t G., C a r v e r A., C o t t o m D. e.a. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Bio/Technology, 1991, 9: 830-835.

• 14.    V e l a n d e r W.H., J o h n s o n J.L., P a g e R.L. e.a. High-level expression of a heterologous protein in the milk of transgenic swine using the cDNA encoding human protein C. Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89: 12003-12007.

71 (Suppl. 3): 10-15.

Биотехцентр НИИ пушного звероводства и кролиководства, 142712, Московская обл., Ленинский р-н, пос. Горки Ленинские, ул. Административная, 2