Спектрофотометрическое определение витаминов В1, В6, В12 в лекарственных препаратах

Витамины являются биологически активными соединениями и относятся к числу жизненно необходимых веществ [1]. Они делятся на две группы: жирорастворимые и водорастворимые. Поскольку витамины не синтезируются организмом человека их содержание необходимо пополнять через пищу. Для компенсации недостаточного поступления витаминов с пищей в последние годы все чаще используются поливитаминные комплексы и пищевые добавки.

Значительную долю в многообразии витаминов занимают представители группы B. В эту группу входят 8 витаминов и 3 витаминоподобных вещества: В 1 – тиамин, В 2 – рибофлавин, В 3 – ниацин или никотиновая кислота, В₅ – пантотеновая кислота, В₆ – пиридоксин, В₇ – биотин, В₉ – фолиевая кислота, В 12 – цианокобаламин и B 4 - холин, B 8 - инозит, B 10 - парааминобензойная кислота. Иногда в этот перечень дополнительно включают B₁₃ – оротовую и В₁₅ – пангамовую кислоты. Все эти вещества хорошо растворимы в воде и играют важную роль в обеспечении здоровья нервной системы, кожи, глаз, печени и других органов. Водорастворимые витамины группы В необходимы для нормального углеводного и белкового обмена [2]. Среди витаминов группы В особого внимания заслуживают В₁, В₆ и В₁₂. Каждый из них играет важную роль в жизнедеятельности организма человека.

Витамин В₁ (тиамин) содержит пиримидиновое кольцо (2,5-диметил 1,6-аминопиримидин) и тиазолиевое кольцо (4 метил-5-гидроксиэтилтиазол) (рис. 1). В₁ участвует в росте и производстве энергии АТФ, а также способствует передаче нервных импульсов (нейромедиатор). Установлено, что В 1 является составной частью минимум пяти ферментов, участвующих в промежуточном обмене веществ [1]. Витамин В₁ содержится в дрожжах, хлебе из муки грубого помола, сое, фасоли, горохе, меньше в картофеле, моркови, капусте, из животных продуктов – в субпродуктах. Недостаток тиамина влияет на многие системы органов, включая сердечно-сосудистую, опорнодвигательную, боли в животе, неприятное вздутие живота и нарушения в нервной системе [3].

он

Рис. 1. Структура витамина В 1

Витамин В 6 - это несколько сходных по химической природе веществ, также называемых пиридоксином, пиридоксалем, пиридоксамином (рис. 2). В₆ участвует в образовании красных кровяных телец, регулирует уровень сахара в крови, транспортирует O 2 , участвует в синтезе ДНК, играет фундаментальную роль в психическом равновесии и настроении (допамин, серотонин и норадреналин). Недостаток витамина В 6 вызывает нарушения аминокислотного обмена в головном и спинном мозге [4]. Витамин В₆ содержится в продуктах животного и растительного происхождения: хлеб, горох, фасоль, мясопродукты.

Рис. 2. Структура витамина В 6

Витамин В 12 (кобаламин) - уникальный витамин, содержащий кобальт (4,3 %) (рис. 3), который необходим организму для кроветворения, работы нервной системы. Международное общество спортивного питания рассматривает кобальт как абсолютно необходимую составную часть витамина В 12 , который не является допингом и не запрещён ВАДА. Гемоглобин, содержащийся в эритроцитах, обеспечивает правильное функционирование мозга при производстве специализированных мембран клеток, образовании ДНК и РНК. Он также участвует в метаболизме аминокислот и макроэлементов, липидов. Витамин B 12 участвует в синтезе группы органических соединений, является важным фактором нормального роста, гемопоэза и развития эпителия, необходим для метаболизма фолиевой кислоты и миелинизации. Отсутствие В₁₂ в пище приводит к развитию гипохромной анемии, которая не лечится препаратами железа [5]. Дефицит витамина B 12 связан с нарушениями нервного развития и нейродегенерацией [6]. Витамин В 12 в основном содержится в пище животного происхождения (субпродукты, мясо, яйца и т.д.) и очень редко присутствует в растениях.

Рис. 3. Структура витамина В 12

Каждый из перечисленных витаминов группы В выполняет свою собственную функцию в организме человека. Систематический анализ биологической роли B 1 , B 6 , B 12 показал многочисленные синергетические взаимодействия этих витаминов на молекулярном уровне, включая метаболизм питательных макросов, образование нейрональных структур, синтез АТФ и т. д. [7]. Сочетание этих трех витаминов В 1 , В 6 и В 12 , которое называют «нейротропными витаминами», является более эффективным в решении проблем неврологического характера [8].

Эти три витамина по отдельности или вместе входят в состав целого ряда лекарственных средств как российского, так и иностранного производства. Для определения витаминов используется вольтамперометрия [9, 10], капиллярный электрофорез [11] и другие инструментальные методы анализа [12]. Традиционно, для молекулярного анализа многокомпонентных смесей органических веществ, применяют хроматографические методы [13-21]. Так, смеси водорастворимых витаминов анализируют методом ВЭЖХ.

Экспериментальная часть

Для проведения эксперимента использовали тиамин, пиридоксин и цианокобаламин фирмы Fluka (фармакопейной чистоты). Исходные водные растворы витаминов (С(В1) = 0,10 моль/л, С(В6) = 0,10 моль/л, С(В12) = 0,01 моль/л) готовили растворением навески субстанции в дистиллированной воде.

Взвешивание проводили на аналитических весах Shimadzu AUX220 с точностью 0,0001 г. Растворы меньших концентраций (4∙10^–4–∙10^–5 моль/л) получали последовательным разбавлением исходных растворов необходимым растворителем (дистиллированной водой, раствором HCl или NaOH).

Спектры поглощения растворов витаминов регистрировали на спектрофотометре Shimadzu UV-1650 pc в кварцевых кюветах (l = 1 см) в диапазоне длин волн 190-800 нм относительно растворителя.

Вычисления проводили с использованием функции Анализ данных в программном обеспечении Microsoft Excel.

Обсуждение результатов

Идея раздельного определения витаминов В 1 , В 6 , В 12 в лекарственных препаратах заключается в количественном переводе аналитов в водный раствор, регистрации спектра поглощения полученного раствора и его математической обработке методом множественной линейной регрессии (МЛР) [22]. Сущность обработки спектров сводится к следующему. Оптическая плотность раствора, содержащего несколько поглощающих веществ, при любой длине волны λ i в соответствии с правилом аддитивности складывается из оптических плотностей каждого вещества. Для раствора, содержащего витамины В 1 , В 6 и В 12 , правило аддитивности оптической плотности может быть записано следующим образом:

^лр—ра при Aj       при Aj ' ^МВ_Ь при Aj ' ^В^ при Aj ^.

С учетом закона Бугера – Ламберта – Бера это соотношение можно переписать в виде:

1        ,                                (2)

р-ра при      в^при^                             в13при^                                 / где ^р—рапри Я[ – оптическая плотность анализируемого раствора при длине волны Л, ; ^BL при Aj , £ВЬ при А; , ^Вхз при Aj – молярный коэффициент поглощения соответствующего витамина при длине волны Л;; l – толщина поглощающего слоя; Св^ ^в^ ^в12 – концентрация соответственно В1, В6, В12 в анализируемом растворе, моль/л.

Записывая это выражение для различных длин волн в интервале от λ 1 до λ n с шагом в 0,1 нм с учетом l =1 см получаем серию уравнений:

^р—ра при Ag ^£B_L при Aj ^"В^ + ^£В_& при Aj ^В₆ + ^£В^ при Ag ^B_L2 ^, ^р—ра при А₃ ^£B_l при А₃ ^B_L + ^£В₆ при А₃ ^В₆ + ^£B_L2 при А₃ ^Вц ^, ^р—ра при Ag ^£B_l при Ag C-B_L "I" ^£В₆ при Ag ^В₆ + ^£B_L2 при Ag ^B_L2 ^,

^p—pa при Aj ^£B_l при Aj ^B_L + ^£B_b при Aj ^B_b + ^£B_L2 при A; ^B_L2 ,

^p—pa при An “Bl при А_п ^В^ + ^Вь при A_n ^B₆ ”*" ^£В₁₃ при An ^Bis .

Каждое из уравнений этой серии включает экспериментально определяемое значение оптической плотности ^p—pa при Л( анализируемого раствора при соответствующей длине волны λ i и искомые значения концентраций витаминов ^B_L> С в_ь’ Cb_L2 . При заведомом отсутствии одного или двух витаминов в анализируемом объекте их концентрации приравниваются к нулю и число слагаемых в уравнении уменьшается. Алгоритм множественной линейной регрессии позволяет по известному набору оптических плотностей ^p—pa при Af в спектре поглощения анализируемого раствора найти значения концентраций витаминов ^B_L’ СB_b’ CB_L2 , наилучшим образом удовлетворяющие всем уравнениям. Статистически большее число уравнений обеспечивает большую точность получаемых результатов. Для реализации этого алгоритма необходимо предварительно установить набор ^В^ при Ai , ^SB_b при Aj , ^B_Ln при Aj при разных λ i . Расчет этих величин можно провести с использование уравнения Бугера – Ламберта – Бера по спектрам поглощения растворов индивидуальных витаминов известной концентрации. Необходимым условием использования метода множественной линейной регрессии является постоянство значений &B_L при Aj , ^£B_b при Aj , “B₁₂ при Aj в широком интервале концентраций.

В этой связи на первом этапе работы были исследованы спектры поглощения водных растворов индивидуальных витаминов при различных условиях в широком концентрационном интервале. Поскольку каждый из витаминов содержит в своем составе различные кислотные и основные группы, то кислотность раствора может оказывать существенное влияние на спектр поглощения витаминов в растворе. Зависимости молярных коэффициентов поглощения водных растворов витаминов от длины волны в 0,1 моль/л HCl, дистиллированной воде, 0,1 моль/л NaOH представлены на рис. 4. Для изучения были выбраны такие концентрационные интервалы, при которых четко проявляются все максимумы поглощения, не сформированный максимум при длине волны 190 нм и менее в расчет не брали.

При выборе интервала концентраций ориентировались также на содержания витаминов в объектах анализа. Из рис. 4 видно, что в дистиллированной воде и 0,1 М NaOH формы спектров поглощения и значения ^£B_L при Л[ , ^£В₆ при Л, , ^£2 при Я( существенно изменяются в зависимости от концентрации поглощающего вещества. Это особенно проявляется в случае B6 и B1 и может быть связано с существованием в этих условиях различных ионных и молекулярных форм витамина. Отщепление или присоединение протона может приводить к внутримолекулярным перегруппировкам, сопровождающимся исчезновением одних хромофорных групп и появлением других. По этой причине указанные растворители не могут быть использованы для спектрофотометрического анализа смеси витаминов. В кислой среде, по всей вероятности, в растворе существуют наиболее протонированные формы и спектры поглощения витаминов остаются практически неизменными в широком интервале концентраций. Все дальнейшие исследования проводили в среде 0,1 моль/л HCl.

Рис. 4. Зависимость молярного коэффициента поглощения В 1 , В 6 , В 12 от длины волны в 0,1 М HCl, Н 2 О, 0,1 М NaOH при различных концентрациях (моль/л)

Для разработки оптимального алгоритма расчета концентраций, обеспечивающего наибольшую точность результатов, проведен сравнительный анализ спектров поглощения всех витаминов в 0,1 моль/л HCl (рис. 5).

Рис. 5. Сравнение спектров поглощения водных растворов витаминов В 1 , В 6 , В 12 в 0,1 М HCl

Спектр В₁₂ наиболее богат полосами поглощения, которые расположены как в видимой, так и в ультрафиолетовой области. Такая форма спектра поглощения хорошо согласуется со сложным строением молекулы, которое включает различные функциональные группы, кратные связи и кобальт (II). Значение молярного коэффициента поглощения наиболее интенсивного максимума достигает 25000. Спектры поглощения В 1 и В 6 содержат по одной хорошо сформированной полосе в ультрафиолетовой области и максимумы поглощения характеризуются гораздо меньшими значениями ε , находящимися в интервале 5000–10000. Обращает на себя внимание существенное поглощение В 12 в этой области, значительно превосходящее поглощение В 1 и В 6 . Таким образом, предварительный сравнительный анализ спектров поглощения витаминов В₁, В₆, В₁₂ может свидетельствовать о возможных концентрационных ограничениях использования предлагаемого подхода для раздельного определения витаминов при совместном присутствии.

Для обеспечения большей точности и избирательности анализа предложен следующий алгоритм обработки спектров. Определение В 12 предлагается проводить по части спектра, при которой поглощает лишь В 12 . В этом случае для расчетов методом МЛР вместо серии уравнений (3) можно использовать серию, включающую более простые уравнения вида:

■^р—ра при Л;   ^В₁₂ при Л, ^В^ ^.

Вычисления целесообразно проводить, учитывая оптические плотности раствора в интервале длин волн от 380 до 600 нм, в котором наблюдается постоянство значений “512 при Л; в наиболее широком концентрационном интервале (рис. 6).

Далее с учетом известной концентрации В 12 можно определить концентрации В 1 и В 6 по серии уравнений (3). Однако при молярных концентрациях В 12 соизмеримых с концентрациями В 1 и В 6 этот подход не даст удовлетворительных результатов из-за значительно превосходящего поглощения В 12 при максимумах поглощения В 1 и В 6 . Расчетным способом можно оценить, что для удовлетворительного определения В1 и В6 методом МЛР по серии уравнений (3) величина ^12 должна быть в 50–100 раз меньше ^B_L ^ £ Б_ь .

Поскольку в лекарственных препаратах содержание В₁ и В₆ на два и более порядка превышает В 12 , то в этом случае поглощение В 12 будет вносить незначительный вклад в общую оптическую плотность анализируемого раствора и для обеспечения большей точности их концентрации могут быть рассчитаны методом МЛР по серии упрощенных уравнений:

^р—ра при Л(    ^B_L при Л; ^В^ + &В₆ при Л; ^В^ ^.

s, л/(моль-см)

^жх*

О 350 нм

О 370 нм

О 380 нм

Д400 нм

X 450 нм

Ж 500 нм О

600 нм

О

□

Ж

0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 Св моль/л

Рис. 6. Зависимость молярного коэффициента поглощения В 12 в 0,1 М HCl от концентрации витамина при различных длинах волн

Наиболее точные результаты могут быть получены при использовании серии уравнений (5) в интервале длин волн 225–308 нм, в котором значения ^£B_L при Л; и ^£Вь при Л, постоянны в широком диапазоне концентраций (рис. 7).

270 НМ

280 НМ

300 НМ

Рис. 7. Зависимость молярного коэффициента поглощения В 1 и В 6 в 0,1 М HCl от концентрации при различных длинах волн

_ 240 НМ

+ 250

НМ

300 НМ

> 310 НМ

^ХХХХ

260 нм

Х310 НМ

Вспомогательные вещества, которые содержатся в лекарственных препаратах и могут переходить в 0,1 М HCl, такие как лидокаина гидрохлорид, бензиловый спирт, полифосфат натрия, гексацианоферрат калия, хлорид натрия, в присутствующих количествах не поглощают при длине волны более 220 нм и не мешают определению витаминов по предложенной методике.

Работоспособность предложенного алгоритма проверена на модельных растворах. Поскольку расчет концентрации витаминов предложено проводить с использованием разных участков спектра, то готовили серию модельных растворов, содержащих витамин В12, и серию растворов с раз- личными концентрациями и соотношением В1 и В6. Основные результаты анализа модельных водных растворов витаминов с использованием предложенного подхода представлены в табл. 1.

Определение витамина В 12 возможно в интервале концентраций 140^-5 ^ 240^-4 моль/л с погрешностью не более 10 %. Присутствие витаминов В 1 и В 6 не влияет на правильность и воспроизводимость результатов анализа.

Использование предложенного подхода для определения В₁ и В₆ возможно при их суммарной концентрации не более 3 • 10^-4 моль/л. Абсолютная концентрация каждого из витаминов и их соотношение влияют на точность полученных результатов. Определение витамина В₆ не вызывает трудностей во всем исследованном интервале концентраций от 240^-5 моль/л до 240^-4 моль/л даже при 10-кратном избытке В 1 . Случайная погрешность определения не превышает 10 % во всем указанном диапазоне концентраций. Возможность определения В 1 существенно зависит от его соотношения с В₆. Правильные результаты удается получить при молярном соотношении В 1 :В 6 не превышающем 1:4. При больших соотношениях наблюдается отрицательная систематическая погрешность. Это, по всей вероятности, обусловлено влиянием атома азота в молекуле В 6 на равновесие между катионной и молекулярной формами тиамина, которые характеризуются различными спектрами поглощения [23, 24].

Таблица 1 Результаты определения витаминов В 1 , В 6 и В 12 в модельных водных растворах 0,1 М HCl при совместном присутствии методом МЛР (Р=0,95; n=3)

Витамин	Введено С, 10–5 моль/л	Найдено С, 10–5 моль/л	S r
В 12	1,00	1,04 ± 0,07	0,016
В 12	2,00	2,01 ± 0,09	0,010
В 12	4,00	3,93 ± 0,12	0,007
В 12	6,00	6,12 ± 0,18	0,008
В 12	8,00	7,89 ± 0,21	0,006
В 12	10,00	10,2 ± 0,3	0,007
В 12	20,00	19,8 ± 0,5	0,006
В 1	2,00	2,10 ± 0,15	0,016
В 6	2,00	2,04 ± 0,13	0,015
В 1	4,00	4,06 ± 0,25	0,014
В 6	4,00	4,00 ± 0,23	0,013
В 1	6,00	6,09 ± 0.43	0,016
В 6	6,00	6,04 ± 0,38	0,015
В 1	8,00	8,23 ± 0,52	0,015
В 6	8,00	8,08 ± 0,55	0,015
В 1	10,00	10,5 ± 0,6	0,013
В 6	10,00	10,2 ± 0,5	0,011
В 1	20,00	20,5 ± 0,9	0,010
В 6	20,00	20,4 ± 0,8	0,009
В 1	20,00	20,3 ± 0,8	0,009
В 6	2,00	1,98 ± 0,11	0,013
В 1	20,00	20,1 ± 0,8	0,009
В 6	4,00	4,03 ± 0,23	0,013
В 1	20,00	19,9 ± 0,9	0,011
В 6	6,00	5,95 ± 0,35	0,014
В 1	20,00	20,2 ± 0,8	0,009
В 6	8,00	8,25 ± 0,52	0,015
В 1	20,00	20,0 ± 0,8	0,009
В 6	10,00	9,8 ± 0,5	0,012
В 1	2,00	2,05 ± 0,13	0,015
В 6	4,00	4,04 ± 0,22	0,013
В 1	2,00	2,00 ± 0,15	0,017
В 6	6,00	6,14 ± 0,23	0,009
В 1	2,00	1,95 ± 0,13	0,016
В 6	8,00	8,25 ± 0,32	0,009

Окончание табл. 1

Витамин	Введено С, 10–5 моль/л	Найдено С, 10–5 моль/л	S r
В 1	2,00	1,82 ± 0,11	0,014
В 6	10,00	9,88 ± 0,42	0,010
В 1	2,00	1,46 ± 0,09	0,014
В 6	20,00	20,3 ± 0,9	0,010
В 1	4,00	3,42 ± 0,23	0,0016
В 6	20,00	20,2 ± 0,8	0,009
В 1	6,00	5,92 ± 0,28	0,011
В 6	20,00	20,2 ± 0,9	0,010
В 1	8,00	8,12 ± 0,42	0,012
В 6	20,00	19,9 ± 0,8	0,009
В 1	10,00	9,25 ± 0,44	0,011
В 6	10,00	9,56 ± 0,38	0,009
В 12	1,00	1,02 ± 0,07	0,016

Предложенный метод может быть использован также для анализа трехкомпонентного раствора, однако, правильные результаты можно получить лишь при условии, что молярные соотношения В 12 :В 1 и В 12 :В 6 более 1:100. При меньших соотношениях значительное поглощение В 12 в аналитическом интервале длин волн (225–308 нм) существенно искажает результаты определения В 1 и В 6 .

Предложенная методика применена для определения содержания витаминов В₁, В₆, В₁₂ в препаратах Мильгамма и Комбилипен в ампулах. Содержимое ампулы (2 мл) количественно переносили в мерную колбу объемом 25 мл и доводили объем раствора до метки 0,1 М HCl. Регистрировали спектр поглощения раствора и рассчитывали содержание витамина В 12 с использованием системы уравнений (4) в интервале длин волн 380-600 нм. Затем разбавляли последовательно раствор препарата в 10³ раз 0,1 М раствором соляной кислоты и регистрировали спектр поглощения от 225 до 308 нм с шагом 0,1 нм. Рассчитывали концентрации витаминов В 1 , В 6 пользуясь системой уравнений (5) и пересчитывали на содержание витаминов в ампуле препаратов. Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты определения витаминов В 1 , В 6 и В 12 в препаратах Мильгамма и Комбилипен (Р=0,95; n=3)

Препарат	Витамины	Введено, мг	Определено, мг	S r
Мильгамма	B 1	100	106±7	0,06
	B 6	100	97±5	0,05
	B 12	1	0,91±0.12	0,11
Комбилипен	B 1	100	104±7	0,07
	B 6	100	98±4	0,05
	B 12	1	1,09±0.11	0,10

Определенное содержание витаминов В 1 , В 6 , В 12 препаратах методом спектрофотометрии соответствует заявленному.

Витамин В12 в лекарственных препаратах содержится в количествах значительно меньших, чем В1 и В6. Для определения содержания витамина В12 в поливитаминном комплексе Пентовит, содержащем В1 (10 мг), В3 (20 мг), В6 (5 мг), В9 (0,4 мг) и В12 (0,05 мг) предложено гомогенное экстракционное концентрирование витамина В12 [25]. Для этого 10 таблеток препарата растирали до однородности в фарфоровой ступке, переносили в мерную колбу и растворяли в воде до 50 мл. Содержимое фильтровали сначала через ватный диск, затем через бумажный фильтр. 5 мл фильтрата переносили в пробирку, добавляли 5 мл воды и 2 мл изопропанола. После перемешивания прибавляли сульфат аммония до выделения экстрагента. По значениям оптических плотностей в интервале 380-600 нм с использованием системы уравнений (4) рассчитали содержание витамина В12. Погрешность определения составила ∼10 %. Для определения витаминов В1 и В6 фильтрат разбавляли в 100 раз 0,1 М раствором соляной кислоты. Определение проводили методом МЛР. Присутствии витаминов В3 и В9 не мешает определению, так ка В3 не поглощает УФ излучение в данной области, а содержание В9 находится ниже предела его определения. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты определения витаминов В 1 , В 6 и В 12 в препарате Пентовит (Р=0,95; n=3)

Витамины	Заявлено, мг	Определено, мг	∆, %
B 1	10	9,6±0,5	4
B 6	5	5,3±0,4	6
B 12	0,05	0,046±0,003	10

Определенное содержание витаминов В1, В6, В12 препаратах методом спектрофотометрии соответствует заявленному.

Выводы

• 1.    Предложена методика спектрофотометрического определения витаминов В 1 , В 6 и В 12 в лекарственных препаратах, основанная на переводе определяемых компонентов в водный раствор и обработке спектров поглощения полученных растворов методом множественной линейной регрессии. Методика не требует дорогостоящего оборудования и может быть реализована в любой аналитической лаборатории.

• 2.    Исследованы спектры поглощения витаминов В 1 , В 6 и В 12 в 0,1 М HCl, дистиллированной воде, 0,1 М NaOH и показано, что постоянство значений молярных коэффициентов поглощения при одинаковых длинах волн, необходимое для реализации метода МЛР, наблюдается только в 0,1 М HCl. В нейтральных и щелочных растворах спектр поглощения изменяется в зависимости от концентрации из-за равновесия между различными ионно-молекулярными формами витаминов.

• 3.    Проведен сравнительный анализ спектров поглощения витаминов В 1 , В 6 и В 12 в 0,1 М HCl и предложены оптимальные условия определения концентрации витаминов в водных растворах при совместном присутствии методом множественной линейной регрессии. Для определения В 12 следует использовать аналитический интервал длин волн 380-600 нм, для определения В 1 и В 6 – 225–308 нм.

• 4.    Изучены возможности применения предложенной методики для анализа водных растворов без предварительного разбавления и показано, что определение витамина В 12 возможно в интервале концентраций 1 - 10 5 ^ 2 - 10 ⁴ моль/л независимо от концентраций В 1 и В 6 . Определение В 1 и В 6 возможно при их суммарной концентрации не более 3 - 10^-4 моль/л и при концентрации В₁₂ менее 2 - 10^-6 моль/л. Присутствие В 1 даже при 10-кратном избытке не влияет на определение витамина В₆ в интервале концентраций от 2 - 10^-5 моль/л до 2 - 10^-4 моль/л. Правильные результаты определения В 1 можно получить при С(В 1 ):С(В₆) <  1:4. Случайные погрешности определения витаминов в указанных условиях не превышают 10 %.

• 5.    Предложено использовать гомогенное концентрирование для определения витамина В₁₂, поскольку его содержание в лекарственных препаратах на несколько порядков меньше содержания других витаминов и находится ниже уровня определяемых концентраций.

• 6.    Предложенная методика использована для определения витаминов В 1 , В 6 и В 12 в препаратах Мильгамма, Комбилипен для инъекций и таблетках Пентовит. Совпадение определенного содержания витаминов В 1 , В 6 , В 12 препаратах методом спектрофотометрии с заявленным свидетельствует о правильности разработанной методики и качестве лекарственных препаратов.