Способ отбора гетерозиготных имидазолиноно-устойчивых растений подсолнечника в условиях фитотрона

Введение. Устойчивость к имидазолиноновым гербицидам, обнаруженная в популяции дикорастущего подсолнечника в 1999 г., привлекла внимание селекционеров во всём мире [3]. Мутантный фермент ALS-синтаза гарантирует устойчивость этой культуры к воздействию гербицидов имидазолинонового ряда, что позволяет использовать их на посевах подсолнечника. Ранее это не удавалось из-за отсутствия резистентности у обычных генотипов. Наследование признака устойчивости подсолнечника к имидазолиноновым гербицидам осуществляется по типу неполного доминирования [2, 5].

Гербицидоустойчивые генотипы выдерживают обработку 2х (двукратной) рекомендованной дозой гербицида в полевых условиях. Как правило, для ускорения селекционного процесса ежегодно практикуется выращивание образцов в камерах фитотрона. Однако в научной литературе отсутствуют сведения об оптимальной дозировке гербицида для обработки растений в условиях искусственного климата.

Рабочая гипотеза основывалась на том, что потенциал генетической устойчивости к гербицидам не безграничен. Так, летом 2004 г. в теплице ВНИИМК проводился опыт по оценке устойчивости к гербициду Пивот, ВК различных генотипов подсолнечника. Исследовались два набора генотипов: гербицидоустойчивая линия НА425, восприимчивая линия ВК876 и F1 НА425×ВК876, а также гербицидоустойчивая линия RHA426, восприимчивая линия ВК508 и F1 RНА426×ВК508. В двух коробах с почвенно-песчаной смесью было выращено по 70 растений каждого набора. На стадии двух пар настоящих листьев растения были обработаны раствором гербицида Пивот, ВК (100 г/л, д.в. имазетапир) в дозировке 2х (концентрация – 6 мл Пи-вота на 1 л воды). Через 10 дней растения всех генотипов, включая гомозиготные имидазолиноно-устойчивые НА425 и RHA426, погибли.

В лаборатории генетики ВНИИМК с донорами гербицидоустойчивости ведётся работа по двум направлениям: создание новых линий генетической коллекции подсолнечника и аналогов уже существующих селекционных линий. Так, с 2005 г. создаются имидазолиноно-устойчивые аналоги линий ВК876, ВК678, ВА93, ВК680, ВК508 и ВА325. Получение аналогов осуществляется путём многократного беккроссирования, т.е. переноса признака с линии-донора на селекционную линию-реципиент. Расщепление в поколениях ВСn происходит по схеме 1:1 (1 гетерозигота : 1 рецессивная гомозигота). При этом важным этапом в успешном создании аналогов является обработка гербицидом растений ВСn с целью отбора устойчивых гетерозигот.

В ходе дальнейших предварительных экспериментов в условиях камеры фитотрона выяснилось, что доза гербицида 1х негативно воздействует на растения ВС n . Даже устойчивые гетерозиготные растения страдают от этой дозы и не переходят в генеративную фазу развития. Поэтому чаще всего создание аналогов линий в фитотроне происходило без обработки гербицидом при гибридизации методом парных скрещиваний, что увеличивало объём опытов в камерах искусственного климата.

В связи с этим целью наших исследований было изучение влияния различных доз гербицида в зависимости от генотипа растений в условиях фитотрона. С помощью предполагаемой оптимальной дозы должны визуально дифференцироваться гетерозиготы и рецессивные гомозиготы, что позволит использовать метод отбора гетерозиготных растений при создании аналогов селекционных линий подсолнечника.

Материалы и методы. Опыт по выявлению оптимальной дозировки гербицида в условиях фитотрона проводился в камере искусственного климата ЦЭБ ВНИИМК с 18 ноября по 29 декабря 2008 г. Использовались светильники Фотос. 4 с лампами ДРИ-2000-6, обеспечивающие освещённость 25 килолюкс при 16часовом световом дне и дневной температуре воздуха около 20˚С. Заделка семян в почву осуществлялась в два короба с почвенно-песчаной смесью (2:1) на глубину 2-3 см. В эксперименте использовалась американская линия-донор признака гербицидоустойчивости RHA426, селекционная R-линия ВНИИМК ВК508 и гибрид F 1 этих линий. RHA426 гомозиготна по гену устойчивости ( Imr Imr ), ВК508 является рецессивной гомозиготой ( imr imr ) и растения F 1 ВК508×RHA426 гетерозиготны по изучаемому признаку ( Imr imr ). Перед обработкой гербицидом была измерена высота растений.

Растения опрыскивали ручным пульверизатором на стадии трёх пар настоящих листьев (V6 – по международной номенклатуре) гербицидом пульсар, ВР (40 г/л, д.в. имазамокс) из группы имидазолинонов.

Для работы был выбран ряд логарифмически снижающихся доз [1], где процент снижения концентрации (Р) составил 50 %: обработка гербицидом в дозировках 1х (3 мл/л), 0,5х (1,5 мл/л), 0,25х (0,75 мл/л) и контроль (опрыскивание водой). Приготовление рабочих растворов гербицида осуществлялось методом последовательного разведения.

Через 14 дней после обработки на стадии развития растений V10 была произведена оценка влияния гербицида на растения и повторно измерена их высота. Прирост растений рассчитывался как разница высоты растения до и после обработки гербицидом:

h V10 – h V6 , (1)

где h – высота растения, V6 и V10 – фаза онтогенеза растения.

Степень поражения гербицидом оценивалась с помощью модифицированной шкалы определения индекса фитотоксичности, где 0% – растения без поражений (контрольные, или не обработанные гербицидом растения); градация 10-30% показывает различную степень хлороза, 40% – полное пожелтение листьев. Интервал 50-90% – повышение степени некроза листьев, а индекс 100% характеризует полностью погибшие от гербицида растения [4].

Эффект действия гербицида на прирост растений различных генотипов рассчитывался по формуле [1], модифицированной в лаборатории генетики ВНИИМК с целью учёта направления (знака) влияния:

р

Э 100 Роп  100,

Рк где Роп и Рк – соответственно показатель состояния тест-объекта в опыте с гербицидом и в контроле.

Результаты и обсуждение. Эффект действия гербицида пульсар на растения отмечался на качественном и количественном уровне во всех вариантах опыта.

Растения линии RHA426 были устойчивы при всех дозах пульсара. При дозе 0,5х и 1х наблюдалось незначительное пожелтение листьев и точки роста. Растения неустойчивой линии ВК508 погибли при всех дозах (рис. 1).

RHA426 ( Imr Imr )

F₁ ( Imr imr )

ВК508 ( imr imr )

Рисунок 1 – Влияние гербицида пульсар на растения различных генотипов подсолнечника в условиях фитотрона через 14 дней после обработки

Слева-направо: контроль, дозы гербицида: 0,25х, 0,5х и 1х

Гетерозиготные растения F 1 выжили при всех вариантах опыта, но при этом с увеличением дозы происходило повышение степени хлороза листьев. При дозе гербицида 0,25х индекс фитотоксичности у гетерозиготных растений составил 10%, но точка роста сохранила свою жизнеспособность (табл. 1).

Таблица 1 – Индекс фитотоксичности¹ исследуемых генотипов, %

Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2008 г.

Вариант	Генотип
	RHA426	ВК508	F 1 (ВК508×RHA426)
Контроль	0	0	0
Доза 0,25х	0	70	10
Доза 0,5х	10	100	20
Доза 1х	20	100	30

Примечание: ¹ – 0 % - растения без поражений;

10-30 % - повышение уровня хлороза;

40 % - полное пожелтение листьев (без некрозов);

50-90 % - полное пожелтение и повышение степени некроза листьев;

100 % - полностью погибшие растения (некротизированные).

Результаты измерения высоты растений на стадиях V6-V10 показали негативное влияние различных концентраций гербицида на прирост у выживших растений RHA426 и F1. Растения линии ВК508 прекратили рост после обработки гербицидом и погибли. Любопытно отметить, что прирост в 1 0,6 см у гомозиготных растений линии RHA426 при обработке 0,25х (0,75 мл/л) был достоверно выше прироста в 8,3 см в контроле (табл. 2), т.е. слабая концентрация гербицида оказала стимулирующее действие на рост растений (рис. 2).

□ RHA426

□ ВК508

□ F1

Доза гербицида

-20

-40

-60

-80

-100

-120

Рисунок 2 – Эффект действия гербицида (ЭД) на прирост растений подсолнечника, %, 2008 г.

Доминантная гомозигота RHA426 показала прирост растений во всех вариантах опыта. В случае дозы 0,25х прирост превысил таковой по сравнению с контролем (табл. 2).

Таблица 2 – Высота и прирост растений подсолнечника, гомозиготного по гену Imr генотипа RHA426

Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2008 г.

Период после всходов, дни	Фаза онтогенеза	Доза гербицида	Средняя высота растения, см	Средний прирост растения, см
20	V6	Контроль	17,6	8,3*
34	V10		25,9
20	V6	0,25х	15,2	10,6*
34	V10		25,8
20	V6	0,5х	13,0	4,6*
34	V10		17,6
20	V6	1х	15,9	3,4*
34	V10		19,3

НСР05=1,8; * – различия достоверны (р<0,05)

Рецессивная гомозигота ВК508 показала прирост растений лишь в контроле (табл. 3). Все три дозы гербицида остановили рост растений и привели к их гибели – тотальному некрозу тканей.

Таблица 3 – Высота и прирост растений подсолнечника селекционной линии ВК508 (imr imr)

Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2008 г.

Период после всходов, дни	Фаза онтогенеза	Доза гербицида	Средняя высота растения, см	Средний прирост растения, см
20	V6	Контроль	12,5	7,6 *
34	V10		20,1
20	V6	0,25х	14,2	0,4
34	V10		14,6
20	V6	0,5х	10,7	-0,6
34	V10		10,1
20	V6	1х	13,9	-0,4
34	V10		13,5
НСР 05 =1,8; * – различия достоверны (р<0,05)

Гетерозиготное поколение показало прирост растений, но в вариантах с гербицидом он был меньше по сравнению с контрольными растениями (табл. 4). Однако степень хлороза у обработанных растений была незначительна (см. табл. 1).

Таблица 4 – Высота и прирост растений генотипа F 1 (RHA426×ВК508)

Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2008 г.

Период после всходов, дни	Фаза онтогенеза	Доза гербицида	Средняя высота растения, см	Средний прирост растения, см
20	V6	Контроль	16,7	12,0 *
34	V10		28,7
20	V6	0,25х	16,4	6,5 *
34	V10		22,9
20	V6	0,5х	14,3	5,6 *
34	V10		19,9
20	V6	1х	14,4	5,2 *
34	V10		19,6

НСР 05 =1,8; * – различия достоверны (р<0,05)

Полученные данные по приросту растений были обсчитаны с помощью приведённой выше формулы (2). Она позволяет измерить эффект действия гербицида, а знак указывает на то, какое это действие – положительное (+) (стимулирующее) или отрицательное ( - ) (угнетающее). Например, -100 % у ВК 508 означает, что гербицид пульсар подействовал отрицательно на линию 100 %, растения прироста не дали (рис. 2). У F 1 негативное действие гербицида уменьшается со снижением дозировки. Интересен факт, что гербицид в дозе 0,25х оказал стимулирующий эффект на рост гомозиготных растений RHA426. Положительный эффект действия гербицида составил +27 %.

В последующих опытах по созданию аналогов селекционных линий подсолнечника в камерах искусственного климата удалось опробовать новую методику на растениях ВС 3 . После обработки 0,25х (0,75 мл/л) раствором гербицида у рецессивных гомозигот наблюдались некрозы листьев и точки роста (рис. 3а). Гетерозиготные по гену Imr растения восстановились спустя 10 дней после обработки (рис. 3б). С такими растениями продолжается дальнейшая селекционная работа по созданию поколений ВС₄.

а

Рисунок 3 – Растения ВС3 при создании аналога линии ВА93, устойчивого к гербицидам из группы имидазолинонов а – гомо- и гетерозиготные растения после обработки гербицидом пульсар; б – гетерозиготное растение, перешедшее в генеративную фазу развития

некроз тканей

гетерозиготное растение

б

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009

Заключение. Гербицид пульсар, ВР (40 г/л) в концентрациях 3,0; 1 ,5 и 0,75 мл/л замедляет рост гербицидоустойчивых гомо- и гетерозиготных растений подсолнечника. Повышение дозы гербицида при этом увеличивает степень пожелтения листьев. Неустойчивые растения при обработке в изученных дозах погибают. Доза гербицида пульсар 0,25х (0,75 мл/л) уничтожает неустойчивые гомозиготные растения, но позволяет выжить гетерозиготам при минимальной степени хлороза листьев, что делает возможным использование этой дозы для отбора гетерозигот в беккроссном потомстве при создании имидазо-линоно-устойчивых аналогов селекционных линий в условиях фитотрона.