Способ получения бруцеллезной сыворотки для проведения диагностических исследовании при бруцеллёзе животных

Проблема ликвидации бруцеллеза является важнейшей задачей для ветеринарной медицины и здравоохранения Казахстана и мира. В связи с изменившимися экономическими отношениями и хозяйственной реструктуризацией в аграрном комплексе в последние десятилетия заболеваемость бруцеллезом динамично возрастает, особенно среди животных крестьянско-фермерских и личных подсобных хозяйств Казахстана [1, 4].

В настоящее время современным методам диагностики и изучению бруцеллезной инфекции в целом посвящено множество работ отечественных ученных [3, 7, 8, 9]. Не вызывают сомнения качество применяемых на сегодняшний день диагностических тестов и их компонентов отечественного и зарубежного производства [1].

Но в нашей стране нет стандартов, подлежащих сравнению и калибровке по отношению к используемым диагностическим тестам и их компонентам, а именно к контрольным бруцеллезным сывороткам, применяемым в серологических реакциях при диагностике бруцеллеза животных. Известны, работы ученых других стран по способу получения позитивных бруцеллезных сывороток и разработки стандартов для их применения [11].

В классификации Международного эпизоотического бюро (МЭБ) существуют Международные стандарты сывороток. Их применяют при международном согласовании диагностических методов и стандартизации бруцеллезных антигенов.

Все стандарты по требованиям МЭБ подлежат сличению и валидации относительно к референсным стандартам МЭБ. Они доступны всем национальным референсным лабораториям МЭБ и должны применяться при утверждении вторичных или национальных стандартов, а по отношению к национальным стандартам в диагностических лабораториях для повседневной рутинной практики разрабатываются и используются рабочие стандарты.

При серологической диагностике бруцеллеза животных для РБП и РСК применяется Международный стандарт иммунной сыворотки МЭБ «OIEISS» (OIE International Standard Serum) (прежде – Вторая международная антисыворотка против Brucella abortus ) [2]. По рекомендациям МЭБ сыворотка изготавливается из материала, полученного от естественно или экспериментально зараженного бруцеллезом крупного рогатого скота, и должна содержать 1000 МЕ/мл (Международных Единиц) агглютинации для РА и РСК [10].

Для постановки прямого и конкурентного ИФА (Иммуноферментный анализ) были созданы сильно положительные (OIEELISASPSS), слабоположительные (OIEELISAWPSS) и отрицательные (OIEELISANSS) стандартные сыворотки МЭБ. Такие сыворотки производят в Великобритании (Veterinary Laboratories Agency). Эти референтные сыворотки можно использовать также для стандартизации при разработке новых методов [2].

С 1993 года Республика Казахстан стала членом МЭБ. С 2011 года проводится активная работа по сотрудничеству с МЭБ.

Основная цель МЭБ направлена на охрану и обеспечение здоровья животных во всем мире независимо от строя и экономического положения государств.

Значимость МЭБ для нашей страны в оказании содействия равноправному выходу на мировой рынок животных и животноводческой продукции в зависимости от эпизоотического благополучия по имеющимся болезням на территории республики, при соблюдении требований МЭБ.

По настоящее время осуществляется долгосрочная стратегия развития ветеринарной службы Республики Казахстан, одобренная и согласованная с МЭБ. Данный процесс затрагивает и вопросы внедрения методик, стандартов, рекомендованных МЭБ на всей территории РК, создания коллекции Национальных стандартных образцов (эталонов) с применением общепринятых международных валидационных процедур.

В связи с этим возникает необходимость разработки способа изготовления стандартной национальной сыворотки с учетом новых подходов и используемых в нашей стране методов получения, относительно рекомендации и требований МЭБ.

Материал и методы исследований. Исследования проводились на базе лаборатории бруцеллеза ТОО «КазНИВИ». Следуя рекомендациям МЭБ, был разработан способ получения в короткие сроки высокоактивной агглютинирующей бруцеллезной сыворотки, после чего была изготовлена и испытана опытная серия бруцеллезной сыворотки в качестве национального стандарта [2, 10].

По литературным данным, международную стандартную сыворотку получали от экспериментально или естественно инфицированного крупного рогатого скота. При экспериментальном заражении в качестве антигена использовали рефренный штамм Brucella abortus 544 (Br. abortus 544), который сначала провели через организм морских свинок с целью освежения биологических свойств. На 21-ый день после заражения провели убой и посев органов морских свинок на питательные среды. У выделенных чистых культур бруцелл изучены культурально-морфологические, тинкториальные и агглютиногенные свойства штамма с целью подтверждения биологических свойств, указанных в паспорте [5].

Предварительно по разработанному методу была проведена иммунизация 5 голов кроликов, которым была введена концентрация микробных клеток в 1000-кратном уменьшении. После получения удовлетворительных результатов исследования продолжили на крупном рогатом скоте. В связи с чем, для получения сыворотки были использованы три головы быков с живой массой 350- 400 кг.

При проведении эксперимента в научно-исследовательских целях с использованием морских свинок, кроликов и быков руководствовались принципами Хельсинской декларации и правилами работы с экспериментальными животными.

До и после месячного карантина, сыворотку крови быков исследовали на бруцеллез в РБП, РА и РСК. После получения отрицательных результатов реакции приступили к иммунизации.

Иммунизацию быков проводили штаммом бактерий Brucella abortus 544. Из штамма Br. abortus 544 приготовили взвесь бруцелл с концентрацией 100 млрд микробных клеток в 1,0 см³ (по бруцеллезному стандарту мутности), который инактивировали в водяной бане при температуре 80 ºС в течение 2 часов, полученную суспензию центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин, супернатант отбрасывали, полученный центрифугат разводили физиологическим раствором до первоначальной концентрации, после чего в приготовленный антиген при интенсивном помешивании добавляли адъювант «Montanide isa 70 vg» из расчета 30,0 см³ на 70,0 см³ антигена при температуре 30 ºС.

Приготовленную таким образом 100 млрд м.к. суспензию бруцелл применяли в качестве антигена, который использовали для иммунизации животных.

Для этой цели быков с живой массой не ниже 350-400 кг, с хорошей упитанностью, иммунизировали предварительно до повторной иммунизации, вводя малую дозу антигена (1,0 см³, чтобы подготовить организм к массивной дозе антигена), потом полную дозу, 100 млрд м.к. взвесью суспензии культуры штамма Br. abortus 544 , быков иммунизировали в область подгрудка подкожно трехкратно в дозе 20,0 см³ с интервалом между инъекциями 7 дней, далее проводили кровопускания через неделю после окончания иммунизации.

Схема иммунизации быков представлена в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что инактивированный антиген вводили 3 раза в дозе 20,0 см³, с интервалом 7 дней. Через 7-10 дней после последней инъекции антигена осуществляли забор крови от каждой головы быка в отдельные емкости. Полученную кровь от каждого быка в отдельных емкостях выдерживали в течение 40 мин в термостате при 37 ° С, затем сгусток крови обводили и оставили в холодильнике (4-8 ° С) на 16-18 часов, после чего отлили сыворотку и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15-20 мин.

Таблица – 1 Схема гипериммунизации быков для получения бруцеллезных сывороток

Материал, используемый для гипериммунизации	Способы введения антигена	Кратность введения и доза	Интервал между инъекциями (в днях)
100 млрд м.к. суспензия бруцелл, инактивированная на дистиллированной воде	Подкожно	3-кратно в дозе 20,0 см3	7 дней

После чего три образца полученных сывороток крови быков проверяли на активность и специфичность путем постановки реакции связывания комплемента (РСК) и реакции агглютинации (РА) до предельного титра с бруцеллезным антигеном по общепринятым методикам [6].

Результат исследований. Для проверки активности и специфичности трех образцов позитивных бруцеллезных сывороток проводили постановку РСК и РА с соответствующим антигеном. Предельным титром сыворотки считают ее наивысшее разведение, дающее с гомологичным антигеном, взятым в удвоенном рабочем титре, задержку гемолиза на 100% эритроцитов в РСК. Испытания проводились с контрольными позитивной и негативной сыворотками. На специфичность проверяли со своим антигенным типом, в реакции показало связывание в 4 креста. Активные и специфические сыворотки консервировали и получили целевой продукт. Результаты исследования активности и специфичности приготовленной сыворотки приведены в таблице 2. Представленные в таблице 2 данные показывают, что сыворотки, полученные вышеописанным способом, дают полную задержку гемолиза эритроцитов с гомологичным единым бруцеллезным антигеном. Титры активности полученных всех трех образцов сывороток равнялись 1:160 в 4 креста. Результаты проверки активности и специфичности позитивных бруцеллезных стандартных сывороток в РА приведены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3 установлено, что в РА наличие агглютинации с предельными титрами трех образцов бруцеллезных сывороток равнялись 1:1600 в 4 креста.

Так как в результате серологических исследований в РА и РСК у всех трех образцов сывороток быков получены в соответвующих разведениях идентичные титры, они были объеденены в одну опытную серию.

Таблица – 2 Результаты проверки активности и специфичности иммунной сывороток в РСК

Типовые антигены в рабочих титрах	Разведение испытуемых сывороток							Титры антител сывороток крови в РСК
	1:5	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
Единый бруцеллезный антиген	++++	++++	++++	++++	++++	++++	-	1:160
Контроль - без антигена	-	-	-	-	-			-

Примечание: «++++» - 100% задержка гемолиза; «+++» - 75% задержка гемолиза;«++» - 50% задержка гемолиза; «+» - 25% задержка гемолиза; « - » - полный гемолиз

Таблица – 3 Результаты проверки активности и специфичности позитивных бруцеллезных стандартных сывороток в РА

Типовые антигены в рабочих титрах	Разведение испытуемых сывороток							Титры антител сывороток крови в РСК
	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200
Единый бруцеллезный антиген	++++	++++	++++	++++	++++	++++	-	1:1600
Контроль - без антигена	-	-	-	-	-	-	-	-

В виду того, что Международная стандартная сыворотка МЭБ содержит в 1 мл 1000 МЕ антител полученную опытную серию сыворотки разбавляли негативной сывороткой от крупного рогатого скота до тех пор, пока ее эффективность не стала максимально приближаться к Международному стандарту.

Заключение. Таким образом, предложенный способ получения гипериммунной бруцеллезной сыворотки для серологических реакций обеспечивает получение в короткие сроки высокоактивной и высокоспецифичной агглютинирующей S-сыворотки с предельными тирами в РСК 1:160 и в РА 1:1600.

На описанный способ получения гипериммунной бруцеллезной сыворотки получен патент на полезную модель.

Следует отметить, что бруцеллезная сыворотка была получена, следуя рекомендациям и требованиям МЭБ, что позволяет использовать ее в качестве национального стандарта и контроля специфичности при исследовании сывороток с R- и S-антигенами и активности S–антигенов. Полученная бруцеллезная сыворотка применима при изучении диссоциации производственных штаммов бруцелл, используемых для изготовления вакцин и лабораторных штаммов при проведении научноисследовательских работ.

• 1.    Белобаб, В. И. Пути совершенствования    диагностики    и

• профилактики бруцеллеза у животных: специальность 16.00.03 – «Ветеринарная микробиология,            вирусология,

• 2.    Бруцеллез (Brucella abortus, B. melitensis и B. suis) Глава 3.1.4. [принят на Всемирной ассамблее делегатов МЭБ май 2016 г.] 65 с. //офиц. сайт URL: https://rr- europe.woah.org/wp- content/uploads/2021/08/3-1-4-brc_.pdf.

• 3.    Даугалиева, А. Т Молекулярногенетическое исследование возбудителя бруцеллеза,     циркулирующего     на

• 4.    Иванов, Н. П.

• 5.    ГОСТ 33675-2015. Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы. Межгосударственный стандарт. изд. офиц.: утв. и введ. Приказом Федер. агентство по техн. регулированию и метрологии от 24 ноября 2015 г. № 1949-ст: введ. впервые: дата введ. 2017-01-01 / разраб. ФГБУ ВГНКИ. – Москва: Изд-во Стандартинформ, 2016. – 18 с.

• 6.    ГОСТ 34105-2017. Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Серологические методы. Межгосударственный стандарт. изд. офиц.: утв. и введ. Приказом Федер. агентство по техн. регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. No 582-ст: введ. впервые: дата введ. 2018-07-01/ разраб. ФГБУ ВГНКИ. – Москва: Изд-во Стандартинформ, 2017. – 23 с.

• 7.    Султанов, А.А. Изготовление и применение антигена для пластинчатой реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза животных: метод. рекомендации по изготовлению и применению / А. А. Султанов,

  Ш. А. Барамова, А. Ж. Мырзалиев. – Алматы: Изд-во Кайрат-принт, 2014. – 10 с.

• 8.    Daugaliyeva, A. Development of a Differential PCR Assay for Detection of Brucella abortus and Brucella melitensis / A. Daugaliyeva, S. Peletto, A. Sultanov, Sh. Baramova [et al.] // Journal of Food Quality and Hazards Control. – 2016. – V. 3. – Р. 53-59. – URL: http://jfqhc.ssu.ac.ir/article- 1-247-en.html (data accepted: 28. 05.2016).

• 9.    Daugaliyeva, A. Genotyping of Brucella melitensis     and Brucella

  abortus strains in Kazakhstan using MLVA-15 / A. Daugaliyeva, A. Sultanov, B. Usserbayev, Sh. Baramova [et al.] // Infect., Genet. Evol. – 2018. – V. 58. – P. 135-144. – https://www.sciencedirect.com/ journal/infection-genetics-and-evolution (data accepted: 20. 03.2018).

• 10.    The Second International Standard for Anti-Brucella abortus Serum / I. Davidson, C. Nancy Hebert, W. J. Brinley Morgan. // Bulletin of the World Health Organization - 1969. – V. 40 (1). – P. 129140. URL :https://apps.who.int/iris/handle/106 65/266505.

• 11.    Patent №  CN102288771B.

10.05.2011: рublication 21.12. 2011 / Dai Zhihong Li Cui, Jiang Hui, Zhang Xiuying, Lu Lianshou.            –            URL:

эпизоотология,       микология       и иммунология»: автореф. дис…д-ра вет. наук / В. И. Белобаб; Казахский научн.-исслед. ветеринарный ин-т – Алматы, 1998. – 52 с.

территории РК / А. Т. Даугалиева, А. К. Мусаева, А. Айткулов // Интеллект, идея, инновация. – 2021. – № 2. – С. 3-9. – DOI: 10.12345/22266070_2021_2_3

Противоэпизоотические мероприятия при бруцеллезе / Н. П. Иванов // Научные и практические основы борьбы с бруцеллезом животных: мат. межд. науч.-практ. конф. (Алматы. - 20 апр. 2014). – КазНИВИ. – Алматы: Из-во АТИП, 2014. – С.145-153.

National standard positive serum for cow brucellosis and preparation method of same: № CN201110119635XA:          application

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ ПРИ БРУЦЕЛЛЁЗЕ ЖИВОТНЫХ

Адамбаева А.А., Мырзалиев А.Ж., Түсіпқанұлы О., Кыдырова Г.Н.

Резюме

В данной статье описан способ получения гипериммунной бруцеллезной сыворотки с учетом рекомендации и требований МЭБ. Была разработана схема иммунизации быков, в качестве антигена применяли бруцеллезный штамм Brucella abortus 544, были изучены культурально-морфологические, тинкториальные и агглютиногенные свойства, которые соответствовали паспортным данным штамма. Инактивированный антиген вводили 3 раза в дозе 20,0 см3, с интервалом 7 дней. Через 7-10 дней после последней инъекции антигена осуществляли забор крови. После чего отделяли сыворотку и проверяли на активность и специфичность путем постановки реакции связывания комплемента (РСК) и реакции агглютинации (РА) до предельного титра с бруцеллезным антигеном. Предложенный способ получения гипериммунной бруцеллезной сыворотки для серологических реакции обеспечивает получение в короткие сроки высокоактивной и высокоспецифичной агглютинирующей S-сыворотки с предельными тирами в РСК 1:160 и в РА 1:1600. Полученная бруцеллезная сыворотка применима в качестве национального стандарта и как контроля специфичности при исследовании сывороток с R- и S-антигенами и активности S–антигенов, а также при изучении диссоциации производственных штаммов бруцелл, используемых для изготовления вакцин и лабораторных штаммов при проведении научно-исследовательских работ.

A METHOD FOR OBTAINING BRUCELLOSIS SERUM FOR DIAGNOSTIC STUDIES IN BRUCELLOSIS OF ANIMALS

Adambayeva A.A., Myrzaliyev A.Zh., Tusupkanuly O., Kydyrova G.N.