Способы хранения культур Clostridium botulinum

Автор: Мустафина Э.Н., Мустафин Т.Р., Садыков Н.С., Юсупов С.А.

Журнал: Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана @uchenye-zapiski-ksavm

Статья в выпуске: 1 т.229, 2017 года.

Бесплатный доступ

Впервые проведены научно-исследовательские работы по сохранению, развитию и использованию генофонда микроорганизмов, патогенных для животных и человека. Для обеспечения долгосрочного хранения с сохранением исходных биологических свойств уникальных коллекционных образцов возбудителя Cl. botulinum нами проводились исследования по детальному изучению влияния способов и сроков их длительного хранения.

Ботулизм, лиофилизация, хранение

Короткий адрес: https://sciup.org/14288898

IDR: 14288898

Текст научной статьи Способы хранения культур Clostridium botulinum

Необходимость стабилизации материалов биологического происхождения, связана с их чрезвычайной нестойкостью, возникла на заре развития биологической науки. Известно, что в обычных условиях продолжительность сохранения большинства биологических препаратов исчисляется несколькими днями. В связи с этим разрабатывались различные способы консервирования биологических препаратов, которые можно разделить в настоящее время на 1) консервирование при положительных температурах; 2) консервирование при низких температурах (замораживание); 3) консервирование высушиванием. Все эти способы используют как в научных исследованиях, так и в производстве биологических препаратов. Высушивание стало неотъемлемым этапом технологии производства ряда вакцин против бактерийных и вирусных инфекций, а также самым надежным способом сохранения коллекционных культур микроорганизмов.

Для обеспечения долгосрочного хранения с сохранением исходных биологических свойств уникальных коллекционных образцов возбудителя Cl. botulinum нами проводились исследования по детальному изучению влияния способов и сроков их длительного хранения. Ботулизм (от латинского слова – колбаса) известен с начала XIX века, когда в 1822 году предположили, что виновницей заболевания является «жирная кислота» колбас. Впервые возбудитель ботулизма Clostridium botulinum (синоним Bacillus botulinus) был описан E.Van Ermengem (1896). В 1897 году Van Ermengem установил связь ботулизма с бактериальным токсином. Возбудители Cl. botulinum классифицируются как один вид, однако это неоднородная группа бактерий.

Ботулизм – острое токсико-инфекционное заболевание, связанное с употреблением в пищу продуктов, содержащих токсин Clostridium botulinum и самих возбудителей, характеризующаяся преимущественным поражением центральной и вегетативной нервной системы. Возбудитель подвижная грамположительная, строго анаэробная спорообразующая бактерия. В мазках имеет вид палочек с закругленными концами, располагающихся беспорядочными скоплениями или небольшими цепочками. В неблагоприятных условиях образует субтерминальные и терминальные споры, в виде которых и сохраняются в окружающей среде. В высушенном состоянии споры могут сохранять жизнеспособность десятилетиями. Известно 8 типов возбудителя ботулизма (А, В, С α , С β , D, E, F, G), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками.

Оптимальный рост клостридий и токсинооб-разование происходят в анаэробных условиях при температуре 350С.

Ботулотоксин является одним из самых сильных биологических ядов. Возможны случаи отравления людей и животных сразу несколькими токсинами, продуцируемых бактериями различных сероваров.

В последние годы в большинстве коллекций микроорганизмов используют метод лиофилизации, низкотемпературного замораживания и хранения в нативном виде.

Лиофилизация (от греч. lyo - растворяю и phileo - люблю), лиофильная сушка, сублимационная сушка, метод высушивания биологических объектов и пищевых продуктов в замороженном состоянии под вакуумом. Лиофилизация широко применяется в ветеринарной, медицинской, биологической практике и пищевой промышленности для длительного сохранения бактерий, вирусов, грибов, диагностических и лечебных биопрепаратов, животных и растительных тканей, продуктов. При лиофилизации вода из объектов удаляется без нарушения нативной структуры белков; в препаратах резко замедляются или прекращаются биохимические реакции, в результате чего они становятся более устойчивыми к факторам внешнего воздействия и сохраняют первоначальные свойства в течение длительного периода хранения. Препараты, высушенные методом лиофилизации, обладают хорошей растворимостью и при добавлении к ним воды или физиологического раствора легко переводятся в исходное нативное состояние. Преимущества такого способа высушивания - отсутствие воздействия высоких температур на препарат, сохранение дисперсной фазы препарата, возможность использования летучих растворителей. Метод лиофилизации позволяет получать сухие ткани, препараты, продукты и т.п. без потери их структурной целостности и биологической активности. При лиофилизации большинство белков не подвергается денатурации и может длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0 °C) [1].

Материалы и методы. Лиофилизация обеспечивает для широкого круга микроорганизмов большую стабильность, чем общеизвестные способы высушивания и периодических пересевов. Метод удобен для практических целей, так как дает возможность иметь большое число ампул каждой культуры. Для сохранения исходных свойств препаратов или высокой жизнеспособности микроорганизмов в процессе лиофилизации и последующем хранении используют различные защитные среды (стабилизаторы): сыворотку крови животных, альбумин, обезжиренное молоко, желатину, желатозу, пептон, сахарозу, сорбит, поливинилпирролидон, глутамат натрия и их комбинации. Метод заключается в высушивании культур под вакуумом при низких температурах (-20 ⁰; -40 ⁰ С).

Результаты исследований. На базе лаборатории «Коллекции микроорганизмов» при ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань было изучено и установлено, что возбудитель Clostridium botulinum сохранил свои свойства по истечению 35 лет их хранения в лиофилизированном и нативном состоянии.

Таблица 1 - Сравнительная оценка лиофилизированных штаммов Cl. botulinum

Наименование

Тип токсина

Культурально-биохимические свойства

Обезжир. молоко

МПЖ

H 2 S

Среда Гисса

глюкоза

лактоза

сахароза

мальтоза

дульцит

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

198 0

2015

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г-

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

о/ не значит

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

Примечание: п – пептонизирует, р – разжижает, о – образует сероводород, к – кислоту, г – газообразование

Для определения жизнеспособности возбудителя и изучения их культуральнобиохимических свойств использовали питательные среды как: обезжиренное молоко, МПЖ (мясо-пептонный желатин), среду Гисса

(малый пестрый ряд: глюкоза, мальтоза, дульцит, маннит, сахароза, лактоза) и среда на образование сероводорода.

После изучения свойств возбудителя, была проведена сравнительная характеристи- ка между полученными и паспортными данными культур (таблица 1). По данным полученных результатов отмечается незначительное снижение образования фермента желатиназы, образование конечного продукта - сероводорода, а так же ферментативной активности.

В большинстве коллекций микроорганизмов используют хранение препаратов в нативном виде. Для сохранения возбудителя Clostridium botulinum в нативном виде используют жидкую анаэробную питательную среду: среда Китта-Тароцци с 1% глюкозой, под слоем вазелинового масла, рН 7,4. Хранятся при комнатной температуре, периодичность пересевов один раз в квартал (таблица 2).

Таблица 2 - Сравнительная оценка нативных штаммов Cl. Botulinum

Наи мено-вание

Тип

Культурально-биохимические свойства

Обезжир. молоко

МПЖ

H 2 S

Среда Гисса

глюкоза

лактоза

маннит

мальтоза

сахароза

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

к/г

к/-

к/г

р/обр газ

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

о не значит

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

-/обр газ

к/г

к/-

Обозначение: п – пептонизирует, р – разжижает, о – образует сероводород, к – кислоту, г – газообразование

Культурально-биохимические свойства 7 типов возбудителя Cl. botulinum при 140 кратных ежеквартальных пересевах с 1980 по 2015 годы показали некоторые изменения их свойств: отсутствие сероводорода и газообразования, а так же снижение разжижения желатины.

Заключение. Проведенными исследованиями культурально-биохимических свойств 7 типов возбудителя Cl. botulinum через 35 лет их хранения методом лиофилизации и ежеквартальными пересевами (140 раз) показало преимущество метода лиофилизации, перед методом нативного хранения.

Резюме

Список литературы Способы хранения культур Clostridium botulinum

Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. -Москва: Изд. «Колос», 1971. -С.342.
Никифоров В.В. Ботулизм: учебно-методическое пособие для врачей/В.В. Никифоров, Н.А. Малышев, Б.И. Санин. -М., 2003. -32 с.
Методические рекомендации «Асептическое производство медицинской продукции» Ч.3 Лиофилизация, Москва: Изд. «Стандартинформ», 2012.-С.16.

Статья научная