Способы хранения культур Clostridium botulinum

Мустафина Э.Н.; Мустафин Т.Р.; Садыков Н.С.; Юсупов С.А.; Mustafina E.N.; Mustafin T.R.; Sadykov N.S.; Yusupov S.A.

Способы хранения культур Clostridium botulinum

Автор: Мустафина Э.Н., Мустафин Т.Р., Садыков Н.С., Юсупов С.А.

Журнал: Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана @uchenye-zapiski-ksavm

Рубрика: Ветеринария

Статья в выпуске: 1 т.229, 2017 года.

Бесплатный доступ

Впервые проведены научно-исследовательские работы по сохранению, развитию и использованию генофонда микроорганизмов, патогенных для животных и человека. Для обеспечения долгосрочного хранения с сохранением исходных биологических свойств уникальных коллекционных образцов возбудителя Cl. botulinum нами проводились исследования по детальному изучению влияния способов и сроков их длительного хранения.

Ботулизм, лиофилизация, хранение

Короткий адрес: https://sciup.org/14288898

IDR: 14288898 | УДК: 619:5А3:636.2

Ways of storage Clostridium botulinum

For the first time carried out research and development work on the conservation and use of genetic diversity of microorganisms, pathogens for animal and human rights. To ensure long-term storage to preserve the original biological properties Unique collectable sample Cl. Botulinum, we conducted Studies on detailed study of ways and the time long-term storage.

Текст научной статьи Способы хранения культур Clostridium botulinum

Необходимость стабилизации материалов биологического происхождения, связана с их чрезвычайной нестойкостью, возникла на заре развития биологической науки. Известно, что в обычных условиях продолжительность сохранения большинства биологических препаратов исчисляется несколькими днями. В связи с этим разрабатывались различные способы консервирования биологических препаратов, которые можно разделить в настоящее время на 1) консервирование при положительных температурах; 2) консервирование при низких температурах (замораживание); 3) консервирование высушиванием. Все эти способы используют как в научных исследованиях, так и в производстве биологических препаратов. Высушивание стало неотъемлемым этапом технологии производства ряда вакцин против бактерийных и вирусных инфекций, а также самым надежным способом сохранения коллекционных культур микроорганизмов.

Для обеспечения долгосрочного хранения с сохранением исходных биологических свойств уникальных коллекционных образцов возбудителя Cl. botulinum нами проводились исследования по детальному изучению влияния способов и сроков их длительного хранения. Ботулизм (от латинского слова – колбаса) известен с начала XIX века, когда в 1822 году предположили, что виновницей заболевания является «жирная кислота» колбас. Впервые возбудитель ботулизма Clostridium botulinum (синоним Bacillus botulinus) был описан E.Van Ermengem (1896). В 1897 году Van Ermengem установил связь ботулизма с бактериальным токсином. Возбудители Cl. botulinum классифицируются как один вид, однако это неоднородная группа бактерий.

Ботулизм – острое токсико-инфекционное заболевание, связанное с употреблением в пищу продуктов, содержащих токсин Clostridium botulinum и самих возбудителей, характеризующаяся преимущественным поражением центральной и вегетативной нервной системы. Возбудитель подвижная грамположительная, строго анаэробная спорообразующая бактерия. В мазках имеет вид палочек с закругленными концами, располагающихся беспорядочными скоплениями или небольшими цепочками. В неблагоприятных условиях образует субтерминальные и терминальные споры, в виде которых и сохраняются в окружающей среде. В высушенном состоянии споры могут сохранять жизнеспособность десятилетиями. Известно 8 типов возбудителя ботулизма (А, В, С α , С β , D, E, F, G), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками.

Оптимальный рост клостридий и токсинооб-разование происходят в анаэробных условиях при температуре 350С.

Ботулотоксин является одним из самых сильных биологических ядов. Возможны случаи отравления людей и животных сразу несколькими токсинами, продуцируемых бактериями различных сероваров.

В последние годы в большинстве коллекций микроорганизмов используют метод лиофилизации, низкотемпературного замораживания и хранения в нативном виде.

Лиофилизация (от греч. lyo - растворяю и phileo - люблю), лиофильная сушка, сублимационная сушка, метод высушивания биологических объектов и пищевых продуктов в замороженном состоянии под вакуумом. Лиофилизация широко применяется в ветеринарной, медицинской, биологической практике и пищевой промышленности для длительного сохранения бактерий, вирусов, грибов, диагностических и лечебных биопрепаратов, животных и растительных тканей, продуктов. При лиофилизации вода из объектов удаляется без нарушения нативной структуры белков; в препаратах резко замедляются или прекращаются биохимические реакции, в результате чего они становятся более устойчивыми к факторам внешнего воздействия и сохраняют первоначальные свойства в течение длительного периода хранения. Препараты, высушенные методом лиофилизации, обладают хорошей растворимостью и при добавлении к ним воды или физиологического раствора легко переводятся в исходное нативное состояние. Преимущества такого способа высушивания - отсутствие воздействия высоких температур на препарат, сохранение дисперсной фазы препарата, возможность использования летучих растворителей. Метод лиофилизации позволяет получать сухие ткани, препараты, продукты и т.п. без потери их структурной целостности и биологической активности. При лиофилизации большинство белков не подвергается денатурации и может длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0 °C) [1].

Материалы и методы. Лиофилизация обеспечивает для широкого круга микроорганизмов большую стабильность, чем общеизвестные способы высушивания и периодических пересевов. Метод удобен для практических целей, так как дает возможность иметь большое число ампул каждой культуры. Для сохранения исходных свойств препаратов или высокой жизнеспособности микроорганизмов в процессе лиофилизации и последующем хранении используют различные защитные среды (стабилизаторы): сыворотку крови животных, альбумин, обезжиренное молоко, желатину, желатозу, пептон, сахарозу, сорбит, поливинилпирролидон, глутамат натрия и их комбинации. Метод заключается в высушивании культур под вакуумом при низких температурах (-20 ⁰; -40 ⁰ С).

Результаты исследований. На базе лаборатории «Коллекции микроорганизмов» при ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань было изучено и установлено, что возбудитель Clostridium botulinum сохранил свои свойства по истечению 35 лет их хранения в лиофилизированном и нативном состоянии.

Таблица 1 - Сравнительная оценка лиофилизированных штаммов Cl. botulinum

Наименование

Тип токсина

Культурально-биохимические свойства

Обезжир. молоко

МПЖ

H 2 S

Среда Гисса

глюкоза

лактоза

сахароза

мальтоза

дульцит

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

198 0

2015

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г-

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

о/ не значит

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

Примечание: п – пептонизирует, р – разжижает, о – образует сероводород, к – кислоту, г – газообразование

Для определения жизнеспособности возбудителя и изучения их культуральнобиохимических свойств использовали питательные среды как: обезжиренное молоко, МПЖ (мясо-пептонный желатин), среду Гисса

(малый пестрый ряд: глюкоза, мальтоза, дульцит, маннит, сахароза, лактоза) и среда на образование сероводорода.

После изучения свойств возбудителя, была проведена сравнительная характеристи- ка между полученными и паспортными данными культур (таблица 1). По данным полученных результатов отмечается незначительное снижение образования фермента желатиназы, образование конечного продукта - сероводорода, а так же ферментативной активности.

В большинстве коллекций микроорганизмов используют хранение препаратов в нативном виде. Для сохранения возбудителя Clostridium botulinum в нативном виде используют жидкую анаэробную питательную среду: среда Китта-Тароцци с 1% глюкозой, под слоем вазелинового масла, рН 7,4. Хранятся при комнатной температуре, периодичность пересевов один раз в квартал (таблица 2).

Таблица 2 - Сравнительная оценка нативных штаммов Cl. Botulinum

Наи мено-вание

Тип

Культурально-биохимические свойства

Обезжир. молоко

МПЖ

H 2 S

Среда Гисса

глюкоза

лактоза

маннит

мальтоза

сахароза

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

1980

2015

к/г

к/-

к/г

р/обр газ

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

о не значит

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

к/-

к/г

-/обр газ

к/г

к/-

Обозначение: п – пептонизирует, р – разжижает, о – образует сероводород, к – кислоту, г – газообразование

Культурально-биохимические свойства 7 типов возбудителя Cl. botulinum при 140 кратных ежеквартальных пересевах с 1980 по 2015 годы показали некоторые изменения их свойств: отсутствие сероводорода и газообразования, а так же снижение разжижения желатины.

Заключение. Проведенными исследованиями культурально-биохимических свойств 7 типов возбудителя Cl. botulinum через 35 лет их хранения методом лиофилизации и ежеквартальными пересевами (140 раз) показало преимущество метода лиофилизации, перед методом нативного хранения.

Резюме

Список литературы Способы хранения культур Clostridium botulinum

Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. -Москва: Изд. «Колос», 1971. -С.342.
Никифоров В.В. Ботулизм: учебно-методическое пособие для врачей/В.В. Никифоров, Н.А. Малышев, Б.И. Санин. -М., 2003. -32 с.
Методические рекомендации «Асептическое производство медицинской продукции» Ч.3 Лиофилизация, Москва: Изд. «Стандартинформ», 2012.-С.16.