Способы получения каротиноидного пигмента и разработка технологии красителя на его основе

Введение. Каротиноиды являются жирорастворимыми пигментами, обеспечивающими большое разнообразие цветовых характеристик не только растительных организмов, но также грибов и бактерий. Данные пигменты являются полиизопреновыми соединениями, в составе которых восемь изопреновых звеньев. На основании этого их относят к группе тетратерпеноидов. Наиболее характерной чертой каротиноидов является наличие сопряженных двойных связей, которые образуют центральную часть молекулы. Каротиноиды насчитывают около 700 соединений, которые можно классифицировать на бескислородные – каротины (α-каротин, β-каротин, ликопин и др.) и окисленные – ксантофиллы, в молекулах которых присутствует кислород в составе спиртовой, кето- или эпоксидной группы (лютеин, зеаксантин, фукоксантин, β-криптоксантин и др.) [1]. Химические и структурные формулы некоторых каротиноидов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Тривиальное название	Эмпирическая формула	Структурная формула
Бескислородные
α-каротин	C 40 H 56	^^J^^^^
β-каротин	C 40 H 56	1^^-^Д<^ч^<^^
Окисленные
Лютеин	C 40 H 56 O 2	но
Зеаксантин	C 40 H 56 O 2	НО '	j^x^v^JQ
β-криптоксантин	C 40 H 56 O	но *

Химические и структурные формулы некоторых каротиноидов Chemical structure of some carotenoids

В зеленых растениях каротиноиды находятся в хлоропластах, однако наибольшее их содержание наблюдается в хромопластах корней, цветков и плодов.

Каротиноиды обладают выраженной антиоксидантной способностью и терапевтической активностью. Поэтому включение в питание человека растительной пищи, богатой каротиноидами, может значительно снизить риск возникновения некоторых заболеваний, таких как онкологические, сердечно-сосудистые, возрастная макулярная дегенерация и катаракта [2–6].

Между тем каротиноиды могут рассматриваться как красители, поскольку они способны окрашивать пищевые продукты в желтые, оранжевые или красные цвета [7, 8], а также сохранять цвет изделия во время технологической обработки, усиливать уже имеющуюся окраску продукта, обогащать его биологически активными соединениями [9].

Одним из наиболее ценных источников каротиноидов является тыква. Общее содержание каротиноидов в тыкве варьирует в пределах от 234,21 до 404,98 мг в 100 г продукта [10, 11]. Такой широкий диапазон значений может зависеть от сорта и вида сырья (генетических особенностей), почвенно-климатических условий, а также процедуры экстракции (способа, типа растворителя и т. д.).

Поскольку каротиноидные пигменты, благодаря углеводородной структуре, являются гидрофобными соединениями, самыми популярными способами их извлечения из растительного сырья являются методы с использованием органических растворителей и растительных масел. В настоящее время н-гексан является одним из наиболее используемых растворителей. Однако растворители нефтехимического происхождения являются токсичными соединениями и поэтому строго регулируются техническими регламентами ЕАЭС041/2017«О безопасности химической продукции», а также Европейского парламента и Совета ЕС (REACH), согласно которым происходит разрешение или ограничение к применению данных химических веществ [9, 12]. Поэтому поиск эффективных способов экстрагирования с использованием менее токсичных растворителей, способных проникать в растительную ткань и экстрагировать каротиноиды, находящиеся в структуре хлоропласта, является актуальным.

Цель исследования – поиск эффективных способов выделения каротиноидов, позволяющих наиболее полно экстрагировать пигмент из растительного сырья, а также создание на его основе натурального красителя, обладающего способностью к окрашиванию различных групп пищевых продуктов.

Задачи: определить экстрагенты и рациональные условия экстрагирования каротиноидов из мякоти тыквы, а также на основе экстрактов каротиноидного пигмента разработать технологию натурального красителя, обладающего способностью к окрашиванию различных групп пищевых продуктов.

Объекты и методы. В качестве объектов исследования в данной работе рассматривались тыква детская деликатесная, экстракты каротиноидов и каротиноидный краситель. Подготовка сырья включала промывание свежих плодов тыквы, их очистку от кожуры, нарезку на кубики размером 1 × 1 см и последующее пюри-рование в измельчителе тканей в течение 5 мин до получения однородной массы.

Экстрагирование каротиноидов проводилось водой при температурах 25 и 50 °С 95 % этанолом и рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом при комнатной температуре. Во всех случаях соотношение сырья к растворителю составляло 1 : 5, а процесс длился 30 мин при постоянном перемешивании.

Ультразвуковую экстракцию каротиноидов 95 % этанолом проводили при температуре 25 °C в течение 10–30 мин, рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом в течение 30 мин с использованием ультразвуковой ванны Сапфир (Россия) при частоте воздействия 25 кГц и мощности 150 Вт.

Экстрагирование с применением полярных растворителей (95 % этанол, ацетон, этилацетат) и их смесей в различных соотношениях проводилось при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании.

Для оценки интенсивности окраски экстрактов каротиноидов измеряли их оптическую плотность на спектрофотометре UV–1800 Shimadzu (Япония) в диапазоне длин волн 280–700 нм.

Каротиноидный краситель получали путем концентрирования каротиноидного экстракта на вакуумном (роторном) испарителе Hei-VAP Advantage ML/G3B (Германия) до уменьшения объема в 5 раз. Затем концентрат подвергали лиофильной сушке на установке Martin Christ

Alpha 2-4 LSCplus (Германия) до получения порошка.

Для исследования структуры полученного порошка и экстракта каротиноидов использовали инфракрасный спектрофотометр IRTracer-100 (Shimadzu, Япония).

Количественное содержание каротиноидов в экстрактах и красителе определяли спектрофотометрическим методом в перерасчете на β-каротин согласно методике, предложенной П.П. Ветровым [13].

Все измерения проводились в четырехкратной повторности с последующим вычислением стандартной ошибки эксперимента.

Результаты и их обсуждение. Поскольку условия экстракции и свойства экстрагента значительно влияют на получение биологически активных соединений из растительного сырья [11, 14, 15], было рассмотрено четыре способа извлечения каротиноидов из мякоти тыквы. В качестве экстрагентов использовали воду при температурах 25 и 50 °С, 95 % этиловый спирт и рафинированное дезодорированное подсолнечное масло. УФ-спектры растворов каротиноидов, полученных данными способами, представлены на рисунке 1. Содержание каротиноидов (в перерасчете на β-каротин) в экстрактах, полученных с использованием различных условий выделения и экстрагентов, приведено в таблице 2.

Рис. 1. УФ-спектры растворов каротиноидов, выделенных из мякоти тыквы различными способами: 1 – 95 % этанол; 2 – подсолнечное масло; 3 – экстрагирование водой при 50 °С;

4 – экстрагирование водой при 25 °С

UV-vis spectra of carotenoid solutions isolated from pumpkin by various methods: 1 – 95 % ethanol;

2 – sunflower oil; 3 – extraction with water at 50 °C; 4 – extraction with water at 25 °C

Таблица 2

Содержание каротиноидов (в перерасчете на β-каротин), выделенных из мякоти тыквы различными способами

Content of carotenoids in terms of β-carotene isolated from pumpkin by various methods

Номер образца	Экстрагент	Температура, °С	Содержание каротиноидов (в перерасчете на β-каротин), мг%
1	95 % этиловый спирт	25	15,32±0,01
2	Подсолнечное масло	25	13,36±0,01
3	Вода	50	8,94±0,01
4	Вода	25	3,43±0,02

Полученные результаты свидетельствуют о ноиды демонстрируют максимумы поглощения в том, что при всех методах экстракции кароти- диапазоне длин волн 420–480 нм.

Наибольшее количество каротиноидов из мякоти тыквы извлекается при использовании 95 % этилового спирта, при этом их содержание в растворе достигает 15,32 мг%. Данные литературы также подтверждают эффективность 95 % этанола для выделения каротиноидных пигментов из растительного сырья [16].

Учитывая, что каротиноиды являются жирорастворимыми соединениями, в ходе исследования также была проведена их экстракция рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом. При таком методе экстракции содержание каротиноидов составило 13,36 мг%, что в 1,2 раза меньше, чем при использовании 95 % этанола.

Экстракция каротиноидов с использованием воды оказалась менее эффективной. При выделении каротиноидов водой при 25 и 50 °C их содержание в растворе составляет 8,94 и 3,43 мг%, что соответственно в 2 и 4 раза ниже, чем при экстрагировании пигментов 95 % этиловым спиртом.

Исследования наличия трех экстремумов на кривых позволяет предположить состав каротиноидов в экстракте из мякоти тыквы. Согласно литературным данным [17], максимумы при длинах волн 423, 450 и 472 нм соответствуют присутствующим в составе экстрактов α-каротину, β-каротину и лютеину.

Таким образом, в результате данного исследования было определено, что наилучшими экстрагентами каротиноидов из мякоти тыквы являются 95 % этиловый спирт и рафинированное дезодорированное подсолнечное масло.

Использование воды в качестве экстрагента для выделения каротиноидов не рекомендуется.

В литературных источниках отмечена эффективность использования ультразвука для извлечения биологически активных соединений из растительного сырья [18–20], позволяющего при более низких температурах и сокращении продолжительности экстрагирования получать ценные и качественные соединения. В целях поиска наиболее рациональных условий процесса экстрагирования в работе было изучено влияние ультразвука на выход каротиноидов из мякоти тыквы, при использовании 95 % этилового спирта и рафинированного дезодорированного подсолнечного масла. Ультразвуковую экстракцию каротиноидов 95 % этиловым спиртом проводили при температуре 25 °C в течение 10, 20 и 30 мин, рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом в течение 30 мин при комнатной температуре. Для сравнения были подготовлены контрольные образцы растворов каротиноидов, экстрагированных 95 % этиловым спиртом и рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом без воздействия ультразвука. УФ-спектры растворов каротиноидов, экстрагированных этиловым спиртом и рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом с применением ультразвука, представлены на рисунках 2 и 3. Содержание каротиноидов (в перерасчете на β-каро-тин) при экстрагировании 95 % этанолом и рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом под воздействием ультразвуковой обработки разной продолжительности представлено в таблице 3.

Рис. 2. УФ-спектры растворов каротиноидов, экстрагированных 95 % этанолом под воздействием ультразвука: 1 – 30 мин; 2 – 20 мин; 3 – 10 мин; 4 – контрольный образец UV-vis spectra of carotenoid solutions extracted with 95 % ethanol under ultrasound:

1 – 30 min; 2 – 20 min; 3 – 10 min; 4 – control sample

Рис. 3. УФ-спектры растворов каротиноидов, экстрагированных рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом под воздействием ультразвука: 1 – 30 мин; 2 – контрольный образец

UV spectra of carotenoid solutions extracted with refined deodorized sunflower oil under the influence of ultrasound:1 – 30 min; 2 – control sample

Таблица3

Содержание каротиноидов при экстрагировании 95 % этиловым спиртом и рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом под воздействием ультразвуковой обработки разной продолжительности

Carotenoid content when extracted with 95 % ethyl alcohol and refined deodorized sunflower oil under the influence of ultrasonic treatment

Номер образца	Способ экстрагирования	Продолжительность экстрагирования, мин	Содержание каротиноидов (в перерасчете на β-каротин), мг%
1	Экстрагирование 95 % этанолом под воздействием ультразвука	10	18,55±0,01
2	Экстрагирование 95 % этанолом под воздействием ультразвука	20	19,46±0,01
3	Экстрагирование 95 % этанолом под воздействием ультразвука	30	19,71±0,01
4	Экстрагирование 95 % этанолом	30	18,20±0,01
5	Экстрагирование рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом под воздействием ультразвука	30	14,34±0,01
6	Экстрагирование рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом	30	13,95±0,02

На рисунках 2 и 3 видно, что воздействие ультразвука оказывает незначительное положительное влияние на экстрагирование каротиноидов из мякоти тыквы. При обработке ультразвуком в течение 10, 20 и 30 мин содержание каротиноидов, экстрагированных 95 % этиловым спиртом, составляет 18,55; 19,46 и 19,71 мг% соответственно. В контрольном образце, экстрагированном 95 % этиловым спир- том, содержание каротиноидов оказалось ниже – 18,20 мг%.

Аналогичная тенденция наблюдается при ультразвуковой экстракции каротиноидов рафинированным дезодорированным подсолнечным маслом (см. рис. 3). Содержание каротиноидов в образце, подвергнутом ультразвуковой обработке, на 3 % выше, чем в контрольном, и составляет 14,34 и 13,95 мг% соответственно. Полученные результаты соответствуют данным литературных источников [21], где также показано незначительное повышение содержания каротиноидов в растворе после ультразвуковой обработки.

Таким образом, применение ультразвука для выделения каротиноидов оказывает лишь незначительное влияние на извлечение пигмента из мякоти тыквы, что делает этот метод малоперспективным для их экстрагирования.

Поскольку выбор экстрагента для выделения биологически активных соединений играет важную роль, к нему должны предъявляться определенные требования. Экстрагент должен обладать высокой экстракционной способностью и избирательностью по отношению к конкретным биологически активным веществам [22]. В связи с этим в ходе исследования был проведен подбор наиболее эффективных экстрагентов для выделения каротиноидов из мякоти тыквы. В качестве полярных растворителей в работе использовались 95 % этиловый спирт, ацетон, этилацетат, а также их смеси. УФ-спектры растворов каротиноидов, полученных с применением указанных растворителей, а также их смесей, представлены на рисунках 4 и 5. Содержание каротиноидов, экстрагированных различными экстрагентами и их комбинациями, приведено в таблицах 4 и 5.

Рис. 4. УФ-спектры растворов каротиноидов, экстрагированных из мякоти тыквы различными растворителями: 1 – ацетон; 2 – этилацетат; 3 – 95 % этанол UV-vis spectra of carotenoid solutions extracted from pumpkin with different solvents: 1 – acetone; 2 – ethyl acetate; 3 – 95 % ethanol

Рис. 5. УФ-спектры растворов каротиноидов, экстрагированных из мякоти тыквы смесями растворителей: 1 – этилацетат/95 % этанол 1 : 1; 2 – этилацетат/95 % этанол 1,0 : 0,5;

3 – этилацетат/95 % этанол 0,5 : 1,0; 4 – этилацетат/95 % этанол 3 : 1;

5 – этилацетат/95 % этанол 1 : 3; 6 – 95 % этанол

UV-vis spectra of carotenoid solutions extracted from pumpkin with solvent mixtures:

1 – ethyl acetate/95 % ethanol 1 :1; 2 – ethyl acetate/95 % ethanol 1 : 0.5; 3 – ethyl acetate/95 % ethanol 0.5 : 1; 4 – ethyl acetate/95 % ethanol 3 : 1; 5 – ethyl acetate/95 % ethanol 1 : 3; 6 – 95 % ethanol

Содержание каротиноидов, экстрагированных из мякоти тыквы различными органическими растворителями Content of carotenoids extracted from pumpkin with various organic solvents

Таблица 4

Номер образца	Растворитель	Содержание каротиноидов (в пересчете на β-каротин), мг%
1	Ацетон	39,53±0,01
2	Этилацетат	24,85±0,01
3	95 % этанол	17,34±0,01

Таблица 5

Содержание каротиноидов, экстрагированных из мякоти тыквы комбинациями растворителей Content of carotenoids extracted from pumpkin with solvent mixtures

Номер образца	Количество 95 % этанола, мл	Количество этилацетата, мл	Содержание каротиноидов (в перерасчете на β-каротин), мг%
1	8	8	37,59±0,01
2	6	10	35,39±0,01
3	10	6	32,96±0,01
4	4	12	28,25±0,01
5	12	4	27,05±0,01
6	16	0	16,00±0,01

Из полученных результатов видно, что экстрагирование каротиноидов ацетоном показало наилучший результат. Содержание каротиноидов в экстракте при данном способе выделения составляет 39,53 мг%. Применение этилацетата в качестве экстрагента привело к снижению эффективности экстракции на 39 %, при этом содержание каротиноидов в экстракте составило 24,85 мг%. Наименее результативным оказался 95 % этиловый спирт. Его применение обеспечило содержание каротиноидов в растворе на уровне 17,34 мг%, что в два раза ниже по сравнению с ацетоном.

Вероятно, различия в полярности растворителей определяют их способность к экстрагированию каротиноидов. Поскольку этиловый спирт является менее полярным по сравнению с ацетоном и этилацетатом, его экстрагирующая способность оказалась наименьшей.

Применение смесей этилацетата и 95 % этилового спирта позволяет повысить выход каротиноидов в раствор (см. рис. 4). Представленные результаты показывают, что наибольшая эффективность экстракции наблюдалась при использовании смеси этих экстрагентов в равных пропорциях. При таком соотношении содержание каротиноидов в экстракте составило 37,59 мг%. Отклонение от этого соотношения в сторону увеличения или уменьшения доли одного из компонентов приводило к снижению эффективности экс- тракции. Минимальное содержание каротиноидов (27,05 мг%) было зафиксировано при соотношении этилацетата и спирта 1 : 3.

Таким образом, наилучшие результаты по выделению каротиноидов из мякоти тыквы достигаются при использовании ацетона либо смеси этилацетата и 95 % этилового спирта в соотношении 1 : 1.

Высокая степень экстрагирования и насыщенный цвет полученных экстрактов позволяют использовать их для создания натуральных красителей, которые могут служить альтернативой синтетическим в пищевой промышленности.

Процесс производства каротиноидного красителя из мякоти тыквы включает следующие этапы: пюрирование сырья, экстракцию пигмента полярными растворителями или их смесями, центрифугирование экстрактов с отделением плотной фазы, концентрирование в 5 раз с использованием вакуумного (роторного) испарителя и последующую лиофильную сушку. Этот метод обеспечивает полное удаление летучего экстрагента и получение порошкообразного продукта яркожелтого цвета. Технологическая схема производства натурального каротиноидного красителя из мякоти тыквы представлена на рисунке 5.

Внешний вид разработанного каротиноидного красителя представлен на рисунке 6. Показатели качества натурального каротиноидного красителя представлены в таблице 5.

Рис. 5. Технологическая схема получения каротиноидного красителя из мякоти тыквы Technology of obtaining carotenoid dye from pumpkin

Рис. 6. Внешний вид разработанного каротиноидного красителя Appearance of the developed carotenoid dye

Таблица 5

Органолептические и физико-химические показатели качества каротиноидного красителя

Organoleptic and physicochemical quality indicators of carotenoid dye

Показатель	Характеристика
Органолептические показатели
Внешний вид и цвет	Мелкий рассыпчатый порошок ярко желтого цвета
Запах	Тыквенный
Вкус	Сладкий, тыквенный
Физико-химические показатели
Содержание каротиноидов (в перерасчете на β-каротина), мг%	50,56
Растворимость	Водорастворим, полная растворимость
Сроки годности
Не более 9 месяцев при температурах 4–6 °С

Результаты исследования показали, что полученный натуральный каротиноидный краситель представляет собой порошок ярко-желтого цвета (см. рис. 6) с легким тыквенным ароматом и вкусом. Содержание каротиноидов (в перерасчете на β-каротин) в данном красителе составляет 50,56 мг%. Срок хранения красителя не превышает 9 мес. при температурах от 4 до 6 °C.

Также установлено, что разработанный каротиноидный краситель обладает хорошей растворимостью в воде, но практически не раство- ряется в масляных растворах (рис. 7). Приобретение гидрофильных свойств в процессе производства расширяет возможности использования данного красителя в пищевой промышленности, позволяя применять его для окрашивания различных групп пищевых продуктов.

УФ-спектры натурального каротиноидного красителя, а также экстрактов каротиноидов и водного раствора тыквенного красителя фирмы MIXIE представлены на рисунке 8.

Рис. 7. Растворимость разработанного красителя Solubility of carotenoid dye

Рис. 8. УФ-спектры водного раствора тыквенного красителя фирмы MIXIE (1), экстрактов каротиноидов, выделенных спиртом (2) и водным раствором (4), разработанного каротиноидного красителя (3)

UV-vis spectra of an aqueous solution of pumpkin dye from MIXIE (1), carotenoid extracts isolated with alcohol (2) and an aqueous solution (4), developedcarotenoiddye (3)

Анализ данных, представленных на рисунке 8, показывает, что УФ-спектр водного раствора тыквенного красителя фирмы MIXIE (кривая 1) содержит один экстремум, указывающий присутствие в растворе β-каротина.

УФ-спектр разработанного каротиноидного красителя (кривая 3), а также УФ-спектры растворов каротиноидов, экстрагированных из мякоти тыквы этиловым спиртом (кривая 2) и вод- ным раствором (кривая 4), демонстрируют три четко выраженных максимума. Однако на кривой 3 наблюдается смещение максимумов поглощения. Как правило, это связывают с присутствием в исследуемом сырье суммы каротиноидов либо с изменением их растворимости [23]. Вероятно, в процессе производства красителя пигменты подвергаются термоокислению, в результате чего гидрофобные углеводородные каротиноиды окисляются до гидрофильных гидроксилсодержащих соединений. Это приводит к изменению их гидрофобно-гидрофильного баланса. В ходе вакуумной сушки под воздействием органического растворителя, кислорода воздуха и повышенной температуры в углеводородную структуру каротиноидов могут встраиваться атомы кислорода. Это приводит к усилению диполь-дипольных взаимодействий и образованию водородных связей с молекулами воды, а также снижению действия сил Ван-дер-Ваальса за счет уменьшения молекулярной массы пигмента [23]. Данный процесс сопровождается увеличением содержания гидрофильных окисленных ксантофиллов, таких как зеаксан-тин, неоксантин и другие.

Повышенное содержание ксантофиллов в разработанном красителе подтверждено анализом ИК-спектров экстракта каротиноидов и полученного красителя (рис. 9).

Рис. 9. ИК-спектры экстракта каротиноидов (1) и разработанного каротиноидного красителя (2) IR spectra of carotenoid extract (1) and carotenoid dye (2)

ИК-спектры обоих образцов демонстрируют характерные полосы поглощения в диапазоне 600–3900 см ⁻ ¹. Колебания в области 2940 см ⁻ ¹ в сочетании с полосами в пределах 1650–1400 см ⁻ ¹ и 1100–650 см ⁻ ¹ указывают на присутствие полиеновой цепи в молекуле каротиноидов [24, 25].

Появление полос в диапазоне 3300–3450 см ⁻ ¹ свидетельствует о наличии в молекуле каротиноидов О-Н и С-О групп, характерных для кислородсодержащих ксантофиллов. Дополнительные пики в диапазоне 1300–650 см ⁻ ¹ могут быть связаны как с каротиноидами, так и с ксантофиллами [26]. При этом в данном спектральном интервале отмечаются различия, что указывает на увеличение числа окисленных групп в структуре красителя. Этот факт, вероятно, обусловлен протеканием термоокислительных процессов в ходе производства красителя, в результате которых гидрофобные бескислородные каротиноиды превращаются в гидрофильные окисленные ксантофиллы.

Заключение. В ходе исследования проведен поиск рациональных условий экстрагирования каротиноидного пигмента с целью наиболее полного его извлечения из мякоти тыквы. Установлено, что эффективность экстрагирования каро- тиноидов зависит от полярности растворителя. 95 % этанол, являясь менее полярным растворителем по сравнению с ацетоном и этилацетатом, обладает наименьшей экстрагирующей способностью. Показана эффективность использования смесей растворителей для экстрагирования каротиноидов из мякоти тыквы. Наилучший результат показало соотношение этилацетата и этанола, равное 1 : 1. Определено, что малоэффективным способом экстрагирования каротиноидов из растительного сырья является ультразвуковая экстракция. С использованием наиболее эффективных экстрагентов и их смесей была разработана технология получения каротиноидного красителя. Данная технология включает этапы экстрагирования, концентрирования экстрактов и их последующую лиофильную сушку. Полученный каротиноидный краситель представляет собой рассыпчатый порошок желтого цвета, содержащий в своем составе комплекс каротиноидов. Хорошая растворимость разработанного каротиноидного красителя в воде позволяет расширить сферу использования гидрофобных красителей для окрашивания различных групп пищевых продуктов.