Сравнение двух методов искусственного заражения семян льна масличного возбудителями фузариоза in vitro

We tested two methods of artificial infection of oil flax seeds with fusariose pathogen in vitro in order to conduct second screening of the selected perspective strains-antagonists. The both methods appeared to be promising. First method consists of placing oil flax seeds on surface of 15-days colonies of Fusarium pathogen. We recommended to use an aggressive isolate Fusarium poae (Peck) Wollenw., in Lewis . (1) here, it infected about 80% of germinating seeds in three days. The isolate Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wr.) Bilai can be used if it is necessary to create a middle infection plot. In seven days it infected 55 %, and in ten days – 70% of seedlings. Second method consists of placing oil flax seeds on surface of 15-days colonies of Fusarium pathogen which are covered with sterile filter paper. In this case, the isolate Fusarium oxysporum var. orthoceras infecting 55% of seedlings in seven days and 95% in ten days can be used.

Введение. Основными формами проявления фузариоза льна масличного являются корневые гнили (фузариоз всходов), трахеомикозное увядание, побурение верхушек растений и коробочек. В Краснодарском крае наибольшее поражение растений льна фузариозом отмече- но в фазе созревания в форме трахеоми-козного увядания [1; 2; 3].

В основе разработанной нами концепции целенаправленного создания микробиопрепаратов для защиты сельскохозяйственных культур от болезней лежит ступенчатый скрининг выделенных штаммов-антагонистов фитопатогенов, который включает первичную оценку антагонистической активности in vitro к наиболее распространенным и вредоносным возбудителям болезней методом двойных или встречных культур [4; 5]. Затем лабораторные образцы микробиопрепаратов, изготовленные на основе выделенных в первичном скрининге перспективных штаммов, оценивают на фоне искусственного заражения патогенами в лабораторных условиях in vitro , во влажной камере и в почве [6]. Так как применяемый нами метод агаровых блоков [7] для искусственного заражения возбудителями болезней подсолнечника и сои не подходит для культуры льна в связи с малыми размерами семян, мы испытывали модифицированные нами методы, разработанные для заражения фузариозом семян рапса и горчицы [8].

Настоящая работа посвящена испытанию методов искусственного заражения семян льна масличного in vitro наиболее распространенными видами возбудителей фузариоза, выделенных нами на полях ВНИИМК, для дальнейшего проведения вторичного скрининга перспективных штаммов антагонистов.

Материалы и методы. Для заражения семян льна масличного сорта ВНИИМК 620 использовали изоляты возбудителей фузариоза, выделенных нами из корней пораженных растений льна масличного в 2016–2019 гг.: два изолята Fusarium poae (Peck) Wollenw., in Lewis и один изолят Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wr.) Bilai. Определение возбудителей фуза-риоза проводили по определителям Шипиловой [9] и Билай [10].

Испытывали следующие методы искусственного заражения семян льна масличного возбудителями фузариоза in vitro :

• 1    – семена льна раскладывали на поверхность 15-дневных колоний возбудителей фузариоза;

• 2    – семена льна раскладывали на увлажненную стерильной водой фильтровальную бумагу, выстланную на поверхность 15-дневных колоний патогена.

Патогенные изоляты грибов рода Fusarium выращивали на картофельно-сахарозном агаре (КСА) в течение 15 суток при температуре 25 ^оС. Затем в каждую чашку Петри раскладывали по 20 семян льна масличного, при этом верхнюю крышку чашки Петри выстилали стерильной фильтровальной бумагой, смоченной стерильной водой. Повторность 3-кратная. Учёт проводили на третьи, седьмые и десятые сутки.

Результаты и обсуждение. Установлена различная эффективность методов заражения семян льна масличного возбудителями фузариоза in vitro .

При раскладывании семян льна на поверхность 15-дневных колоний патогенов, на третьи сутки в варианте с возбудителем фузариоза F . poae (1) поразились 80 % проклюнувшихся семян. Тогда как в вариантах с изолятами F . poae (2) и F . oxysporum пораженных проростков не было (табл. 1, рис. 1).

Таблица 1

Поражение проростков льна масличного возбудителями фузариоза при испытании метода искусственного заражения раскладыванием семян на поверхность 15-дневных колоний патогена in vitro г. Краснодар, 2019 г.

На седьмые сутки в варианте с изоля-том F . poae (1) количество пораженных проростков составило 85,0 %, при этом все они покрылись мицелием патогена. В варианте с изолятом F . poae (2) проростки выросли, сформировали семядольные листья, но фузариозом не поразились. С изолятом F . oxysporum var. orthoceras поразилось 55,0 % проростков, при этом гипокотили у них были изогнуты и кончики корня сгнили.

На десятые сутки в варианте с изоля-том F . poae (1) количество пораженных проростков сохранилось (85,0 %). В вариантах с изолятом F . poae (2) поразились фузариозом 20,0 % проростков, а с изоля-том F . oxysporum var. orthoceras количество пораженных проростков выросло до 70,0 %, а корни у проросших семян почти полностью сгнили.

Таким образом, при испытании первого метода, при раскладывании семян льна на поверхность 15-дневных колоний патогена, из трех изолятов возбудителей фузариоза наиболее агрессивным показал себя изолят F . poae (1), который уже через трое суток поражал 80,0 % проклюнувшихся семян. При необходимости создания среднего фона можно использовать изолят F . oxysporum var. orthoceras, который через семь суток поражал 55,0 %, а через десять суток – 70,0 % проростков. Изолят F . poae (2) оказался не агрессивным. При испытании второго метода, когда семена льна раскладывали на увлажненную стерильной водой фильтровальную бумагу, выстланную на поверхность 15-дневных колоний возбудителей фузариоза, результаты заражения значительно отличались от предыдущего метода (табл. 2, рис. 2).

Таблица 2

Поражение проростков льна масличного возбудителями фузариоза при испытании метода искусственного заражения раскладыванием семян на увлажненную стерильной водой фильтровальную бумагу, выстланную на поверхность колоний патогена in vitro г. Краснодар, 2019 г.

На третьи сутки во всех трех вариантах с возбудителями фузариоза проростки льна патогенами не поразились. При этом в первых двух вариантах семена льна в большинстве проросли, тогда как в варианте с изолятом F . oxysporum var. orthoceras только проклюнулись.

На седьмые сутки во всех трех вариантах с возбудителями фузариоза проростки льна поразились патогеном, но максимально (55 %) – с изолятом F. oxysporum var. orthoceras.

На десятые сутки во всех вариантах с возбудителями фузариоза произошло увеличение поражения патогеном и максимальное – у изолята F . oxysporum var. orthoceras (95,0 %), при этом корни проростков сгнили.

Таким образом, при испытании второго метода, при раскладывании семян льна на поверхность колоний патогенов, выстланных фильтровальной бумагой, из трех изолятов возбудителей фузариоза наиболее агрессивным показал себя изо-лят F . oxysporum var. orthoceras , который на седьмые сутки поражал 55,0 %, а на десятые – 95,0 % проростков.

Выводы. Для проведения вторичного скрининга штаммов-антагонистов возбудителей фузариоза льна масличного на фоне искусственного заражения патогенами in vitro можно использовать оба испытанных метода. При применении первого метода при раскладывании семян льна на поверхность 15-дневных колоний патогенов, для создания жесткого фона следует использовать изолят F . poae (1), который уже через трое суток поражал 80,0 % проклюнувшихся семян. При необходимости создания среднего фона можно использовать изолят F . oxysporum var. orthoceras, который через семь суток поражал 55,0 %, а через десять суток – 70,0 % проростков. При применении второго метода, при раскладывании семян льна на поверхность колоний патогенов, выстланных фильтровальной бумагой, следует применять изолят F . oxysporum var. orthoceras , который на седьмые сутки поражал 55,0 %, а на десятые – 95,0 % проростков.