Сравнение эффективности плазмид 1 и 3 поколения, кодирующих химерный Т-клеточный рецептор к опухолевому маркеру рака яичников

Лечение и рациональная диагностика онкологических заболеваний в настоящее время являются чрезвычайно важной проблемой. Муцин 16 (MUC 16) занимает особую позицию среди белков, являясь не только диагностическим биомаркером, но и терапевтической мишенью [8, 9, 14]. MUC16 представляет собой высокомолекулярный трансмембранный гликопротеин, который обычно экспрессируется на поверхности определенных типов эпителиальных клеток [11]. Являясь представителем семейства муцинов, он содержится в слизи, покрывающей урогенитальные, дыхательные и пищеварительные тракты, а также конъюнктиву и роговицу. MUC16 в совокупности с другими муцинами защищает их от обезвоживания, инфекций и прочих повреждений (химического или физического характера) [6]. Превращение эпителиальных клеток в злокачественные сопутствуется экспрессией большого количества данного вещества на их поверхности [11].

Роберт Бастом и его коллеги первыми обнаружили MUC16. Ими было отмечено, что опухоль-ассоциативный антиген, экспрессирующий в 80% случаев рака яичников, связывается ранее обнаруженным моноклональным антителом OC125 [4]. Впоследствии новый антиген получил название СА125 (cаncer antigen 125) [5].

В настоящее время CA125 хорошо изучен и обширно используется как опухолевый маркер при раке яичников [2]. Он попадает в кровоток благодаря протеолитическому расщеплению и десквамации N-концевого домена MUC16

(sМUС16) с поверхности клеток опухоли. Антигенный эпитоп CA125 обнаруживают в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа. Его принято считать лучшим биомаркером эпителиального рака яичников серозного типа. Иммунотерапия при раке яичников – перспективный и прогрессивно развивающийся метод, минимально влияющий на нормальные ткани организма, вследствие своей высокой специфичности. Поэтому поиск новейших подходов, в частности возможность использования CAR-T технологии, является актуальной клинической задачей. Известно, что иммунная система играет важную роль не только в этиологии онкологического заболевания, но и определяет его течение. Ключевой задачей фундаментальной науки является изучение взаимодействия клеток опухоли и иммунной системы, поэтому метод обращения собственного иммунитета против развития злокачественного новообразования может со временем быть представлен, как новый и эффективный способ лечения рака.

Один из таких методов – адоптивная иммунотерапия на основе искусственных (химерных) Т-клеточных рецепторов (CAR-therapy). Она включает введение в организм пациента Т-лимфоцитов, генетически модифицированных ex vivo и несущих на своей поверхности искусственный рецептор заданной специфичности. CAR представляет собой белок слияния и состоит из внеклеточного одноцепочечного вариабельного фрагмента иммуноглобулина scFv (single-chain Fv) и внутриклеточных сигнальных доменов Т-лимфоцитов [12]. В отличие от Т-клеточных рецепторов, которые узнают процессированные антигены в составе главного комплекса гистосовместимости, химерные Т-клеточные рецепторы нацелены на распознавание поверхностных нативных (непроцессированных) антигенов, ассоциированных со злокачественной трансформацией клеток [13].

Технология САR даёт возможность вне тела пациента перепрограммировать его собственные иммунные клетки с целью создания химерного рецептора антигена, который может охотиться за раковыми клетками и эффективно разрушает опухоль.

СAR, сконструированные по такому методу, входящие в состав иммунных эффекторных клеток, позволяют последним приобрести высокую избирательность благодаря добавленному рецептору от моноклональных антител. Полученные таким образом клетки после используются для адоптивной иммунной терапии, которая является разновидностью иммунотерапии рака [10].

Изначально химерные антигенные рецепторы имели в своей структуре нормальные рецепторы T-лимфоцитов, включали в себя цитоплазматическую эффекторную и антиген-распознающую части, а также передаточный фрагмент [3]. В дальнейшем были созданы CAR второго и третьего поколения, которые кроме CD3ζ содержали вспомогательные костимулитрующие домены. Чаще всего CAR второго поколения включают цитоплазматический домен молекулы CD28, расположенный между трансмембранным доменом и сигнальной последовательностью, содержащей ITAM [1, 3, 7]. Третье поколение конструкций допускает присутствие трёх внутриклеточных сигнальных доменов. В них, кроме фрагментов СD28 и СD3 ζ, могут содержаться сигнальные последовательности СD137 / 4-1ВВ, DАP10, СD134 / ОХ-40 и прочие.

Цель данной работы: (1) исследование и выбор оптимальной плазмиды 1 и 3 поколений, содержащей ген мономолекулярного химерного Т-клеточного рецептора к опухолеспецифическому антигену CA125, предназначенной для пассивной иммунотерапии опухолей; (2) оценка функциональности полученных рекомбинантных плазмид на клетках рака молочной железы (МСF-7) и лимфоцитах человека.

Материалы и методы

В работе использованы линии клеток рака яичника человека OVCAR-3, OVKATE и MCF-7 (рак молочной железы, человек), клетки культивировали в стандартных стерильных условиях с использованием среды DMEM (ПанЭко, Россия) при 5% СО2, 37 °С. Ряд экспериментов проведен на лимфоцитах периферической крови человека, полученных от условно здоровых доноров. Выделение фракции лимфоцитов проведено с помощью наслаивания на раствор фиколла-урографина (плотность 1,077 г/см3) (ПанЭко, Россия). Лимфоциты культивировали в стандартных условиях на среде RPMI (ПанЭко, Россия), с содержанием 10% фетальной бычьей сыворотки (ПанЭко, Россия). Т-лимфоциты активировали добавлением в среду интерлейкина-2 (50 ЕД/мл) (Ронколейкин, БИОТЕК, Россия) и фитогемагглютинина (1 мкг/мл) (ФГА, ПанЭко). Моноклональные биотинилированные мышиные антитела (изотип IgG1), способные в растворе связываться с СА125, были предоставлены OOO «XEМА» (Россия, Москва). Структура антител исследована с помощью методов электрофореза белков (SDS-PAGE) с применением технологии изоэлектрического фокусирования (IEF) (Agilent 7100, ФИЗЛАБПРИБОР, Россия).

Трансфекция Т-лимфоцитов человека и клеток MCF-7 проводилась с использованием прибора Amaxa Nucleofector (Lonza) и наборов «Humаn Т-Cеll Nuсlеоfесtоr Kit» (Lоnzа). Для клеток были использованы программы V-024, Т-020 и Т-023, обеспечивающие высокую эффективность трансфекции данных типов клеток.

Оценка экспрессии Z-цепи Т-клеточного рецептора, а также оценка связывания СА125 в растворе были проведены методом проточной цитометрии (Cytomics FC500, Beckman Coulter, USA). Биотинилированные антитела, для плазмиды plCAl - Х75, для плазмиды р3СА2 - Х181, для р3СА3 - Х189 были предоставлены ООО «ХЕМА» (Россия).

Результаты и обсуждение

Создание генно-инженерных конструкций (плазмид), экспрессирующих химерные T-клеточные рецепторы, которые могли распознать антиген СА125 на поверхностях клеток-мишеней, стало важным этапом проделанной работы. Было продемонстрировано, что трансфицированные такой плазмидой лимфоциты периферической крови человека, приобретают свойства экспрессировать на поверхности мономолекулярный Т-клеточный рецептор специфический к СА125.

Работа включала несколько этапов: на первом этапе проводился выбор целевого эпитопа молекулы антигена СА125; на втором этапе были синтезированы конструкции мономолекулярных рецепторов, включающих последовательности, комплементарные к выбранным участкам, и проведено определение правильности сборки рецепторов на поверхности клеток; на третьем этапе выполнено исследование функциональной активности данных конструкций Т-клеточных рецепторов.

Выбор целевого эпитопа СА125

Были созданы моноклональные биотинилированные мышиные антитела (изотип IgG1), способные связаться в растворе с СА125, а именно: Х193, Х189, Х181, Х144, Х75, Х69.

Также были выбраны три клеточные линии OVKATE, OVCAR-3 (рак яичника, человек), MCF-7. Линия OVCAR-3 и линия OVKATE несут на поверхности клеток антиген СА125, а линия MCF-7 не экспрессирует, поэтому ее использовали в качестве контроля. Структура исследуемых антител была изучена с помощью таких методов, как электрофорез белков (SDS-PAGE) и изоэлектрическое фокусирование (IEF).

Помимо этого для всех представленных антител с помощью метода проточной цитофлуориметрии определили связывание с клеточными культурами рака яичников. На основании результатов связывания антител с поверхностными антигенами СА125 было идентифицировано три антитела, демонстрирующих наивысший уровень связывания с линиями клеток OVKATE и OVCAR-3 - Х189, Х181, Х75. С помощью антител полученных к эпитопам СА125 (Х75, Х181, Х189) были разработаны плазмиды, несущие ген химерного мономолекулярного рецептора. В плазмиду рСI было проведено клонирование фрагментов Т-клеточного рецептора: вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей рецептора, комплементарные к соответствующим участкам антител, гибкий шарнирный участок молекулы СD8, фрагмент СD247, являющийся ζ-цепью Т-клеточного рецептора и включающий поверхностный и внутриклеточный домен. На основании структуры (поколения) рецептора данным конструкциям присвоены названия: р1СА1, р3СА2, р3СА3. В таблице 1 представлены описания последовательностей разработанных плазмидных конструкций.

Таблица 1. Структура плазмид, созданных входе исследования

№	Название	Сокращен ное название	Клон антитела scFv	Шарнир ный участок	Трансмем бранный домен	Активаци онные домены
1	pCI/CA1-CD8-CD247 (pCI/1C6-CD8-CD247)	p1CA1	X75	CD8	CD247	CD247
2	pC1/3CA2-CARg	p3CA2	X181	CD8	CD28	CD28, CD137, CD247
3	pCI/3CA3-CAR3g	p3CA3	X189	CD8	CD28	CD28, CD137, CD247

Оценка функционирования плазмид, кодирующих химерный Т-клеточный рецептор. Исследование поверхностной экспрессии рецептора к СА125 на поверхности клеток MCF-7 после их модификации плазмидами

Клетки линии МСF-7(рак молочной железы человека) не экспрессируют рецепторы к СА125, поэтому появление данных рецепторов на поверхности клеток после внедрения в них плазмидных конструкций может являться показателем правильности сборки Т-клеточного рецептора. Для того, чтобы подтвердить правильность функционирования Т-клеточного рецептора, клетки линии МСF-7

трансфицировали созданными плазмидными конструкциями. Появление после трансфекции иммунореактивных эпитопов ζ-цепи химерного рецептора (СD3ζ) на поверхности клеток МСF-7 является одним из показателей функциональности созданных плазмид. Проверку экспрессии ζ-цепи линии клеток МСF-7 проводили через 24 часа после трансфекции. Для этого клетки обрабатывали меченными антителами к ζ-цепи химерного рецептора и анализировали на проточном цитофлуориметре. Положительный сигнал был обнаружен в клетках, трансфицированных всеми плазмидами, в то время как в не трансфицированных плазмидными конструкциями контрольных препаратах клеток сигнал отсутствовал. Полученные данные указывают на наличие экспрессии химерного иммунорецептора, кодируемого плазмидой р1СА1, и его правильную внутриклеточную сборку. В аналогичных экспериментах с использованием рекомбинантных плазмидных ДНК р2СА2 и р3СА3 (анализ через 24 часа после трансфекции, окрашивание клеток антителами к CD3ζ), экспрессия ζ-цепи была продемонстрирована в 22,3% и 17% клеток соответственно. Это подтверждает правильную сборку Т-клеточных рецепторов, экспрессируемых этими конструкциями. Проведённый после трансфекции плазмидными конструкциями р3СА2 и р3СА3 анализ клеток МСF-7 показал, что кодируемые исследуемой ДНК T-клеточные рецепторы, собираются на поверхности клеток. Это доказывают более высокий уровень экспрессии ζ-цепи по сравнению с рIСА1 и данные по окрашиванию антителами к внутриклеточному фрагменту ζ- цепи. Рисунок 2 показывает результаты связывания трансфицированных клеток с FITC-меченными антителами, полученные с помощью метода проточной цитофлуорометрии. Для всех изученных плазмид сборка химерного Т-клеточного рецептора протекала правильно. Тем не менее, в ходе исследования было установлено, что для каждой плазмидной конструкции свойственны индивидуальные особенности, выраженные в процентном содержании клеток, несущих химерный иммунорецептор и в разных количественных уровнях экспрессии.

Помимо этого, для того чтобы оценить способность трансфицированных клеток MCF-7 связываться с СА125, их инкубировали в течение 30 минут с раствором данного антигена, меченного флуоресцентным красителем FITC (CA125-FITC). Клетки, трансфицированные плазмидами, связывали CA125 в растворе, что было показано после 30 минут инкубации клеток с раствором CA125, меченным FITC. После трансфекции MCF-7 плазмидой р1СА1 положительный сигнал связывания антител был обнаружен у 16,5% клеток в культуре (рисунок 2Б).

Рисунок 2. Цитофлуориметрический анализ связывания клеток MCF-7, трансфицированных плазмидой p1CA1 через 24 часа после трансфекции. (А) Отрицательный контроль (нетрансфицированные клетки MCF-7). (Б) Клетки MCF-7, трансфицированные плазмидной конструкцией р1СА1, через 24 часа после трансфекции с ФИТЦ-СА125 в растворе. (В) Клетки MCF-7, трансфицированные плазмидной конструкцией р1СА1, после окрашивания FITC-меченными антителами к Z- цепи CD3.

Таким образом, было установлено, что в клетках MCF-7, трансфицированных плазмидой р1СА1, химерный Т-клеточный рецептор экспрессирующийся на их поверхности, способен связать антиген СА125 в растворе, как через 24 часа, так и спустя 48 часов после трансфекции. Исходя из полученных результатов (рисунок 2Б и 2В) был сделан вывод, что клетки, трансфицированные плазмидной конструкцией р1СА1, через 24 часа после трансфекции, экспрессируют поверхностный Т-клеточный рецептор к СА125. При увеличении времени инкубации до 48 часов после трансфекции достоверных изменений в результатах получено не было. При дальнейшем изучении плазмид р3СА2 и р3СА3 было показано, что клетки, трансфицированные этими конструкциями, также спустя 24 и 48 часов после трансфекции, связывают антиген CA125-FITC (Таблица 2). Поэтому можно сделать вывод, что кодируемый всеми исследованными плазмидными конструкциями химерный Т-клеточный рецептор, после проведенной процедуры трансфекции, эффективно экспрессируется на поверхности клеток MCF-7. При исследовании различных вариантов плазмид, кодирующих химерный Т-клеточный рецептор, количественный уровень связывания CA125 с трансфицированными клетками MCF-7 в растворе варьировал в зависимости от выбранной конструкции. Были получены значения относительного уровня связывания FITC-CA125 на поверхности трансфицированных клеток (Таблица 2). Самый высокий уровень связывания СА125 был отмечен в клеточной культуре, трансфицированной плазмидой р3СА2. Анализ проводили через 24 и 48 часов после трансфекции. Стоит отметить, что строгой зависимости уровня связывания FITC-CA125 от времени обнаружено не было.

Таблица 2. Результаты оценки связывания антигена CA125-FITC с клетками линии

MCF-7 генно-модифицированными исследуемыми плазмидными конструкциями

Образец (наименование)	24 часа инкубации	48 часов инкубации
	Количество клеток, несущих поверхностный рецептор к СА125, %
MCF-7контроль, нетрансфицированные	0	0
MCF-7, трансфицированные р1СА1	8,3	9,2
MCF-7, трансфицированные р3СА2	22,6	23,7
MCF-7, трансфицированные р3СА3	17,8	16,4

Анализ связывания растворимой формы СА125 с лимфоцитами человека, трансфицированными плазмидами p1CA1, р3СА2, р3СА3

После оценки функциональности полученных плазмид, дальнейшее исследование метода иммунотерапии с использованием конструкций химерных Т-клеточных рецепторов к СА125 проводили на лимфоцитах человека. Проанализированные литературные данные свидетельствуют о том, что для повышения уровня экспрессии химерного рецептора и его способности связываться с соответствующим антигеном, а также в целях повышения эффективности трансфекции, рекомендуется предварительная активация лимфоцитов.

В нашем исследовании было проведено сравнение эффективности плазмидных конструкций р1СА1, р3СА2 и р3СА3 при их трансфекции в не активированные и активированные лимфоциты. Активацию проводили рекомбинантным интерлейкином-2 (IL-2) человека (50 ЕД/мл) с параллельной стимуляцией фитогемагглютенином (PHA) в течение 3 суток. По истечении этого срока доля СD3+ Т лимфоцитов в клеточной культуре составляла 60 ± 10%. Последующая трансфекция лимфоцитов человека плазмидными конструкциями методом электропорации была проведена с использованием прибора Amaxa Nucleofector (LonzaEio).

Для того чтобы оценить способность связывать СА125, нестимулированные лимфоциты трансфицировали плазмидами р1СА1, р3СА2 и р3СА3. Затем спустя 24 и 48 часов после трансфекции инкубировали в течение 30 минут с раствором антигена, меченного флуоресцентным красителем FITC (CA125-FITC). Количество клеток, несущих рецептор CA125 на поверхности и связывающих антиген CA125-FITC, оценивали с помощью проточной цитометрии. Проанализировав диаграммы связывания лимфоцитов, которые были трансфицированы исследуемыми плазмидными конструкциями р1СА1, р2СА2, р3СА3 с СА125-НТС, получили 28%, 43% и 36% связывания соответственно. Тем самым было показано, что самый высокий уровень связывания СА125 наблюдается для лимфоцитов, трансфицированных плазмидой р3СА2.

Результаты цитофлуорометрического анализа связывания FITC-CA125 с предварительно активированными IL-2/PHA лимфоцитами, трансфицированными серией плазмидных конструкций, показали, что уровень связывания CA125 активированными клетками значительно превышает уровень связывания с нестимулированными лимфоцитами, трансфицированными теми же плазмидами (р1СА1, р3СА2,р3СА3), и равен 31%, 72% и 56% соответственно. В результате эксперимента было показано, что предварительная активация лимфоцитов, приводит к увеличению экспрессии Т-клеточного рецептора.

Исследования функциональной активности трёх плазмидных конструкций, несущих Т-клеточный рецептор к СА125, продемонстрировали, что разработанные плазмидные конструкции при трансфекции в клетки человека вызывают экспрессию поверхностных рецепторов к СА125. Установлено, что наиболее перспективной для дальнейших исследований является плазмида р3СА2 (pCI/3СА2-CAR3g, антитело Х181), так как она обладает наибольшей функциональностью и эффективностью. Плазмидная конструкция р3СА2 обеспечивает экспрессию функциональных Т-клеточных рецепторов не только на поверхности лимфоцитов человека, но и на клетках линии MCF-7.

Таким образом, проведенное исследование позволило разработать плазмидную конструкцию к опухолевому антигену СА125, что может являться основой для разработки метода иммунотерапии злокачественных новообразований, при которых опухолевые клетки несут на поверхности СА125 (рак яичника, рак легкого).