Сравнительная оценка антигенной активности и иммуногенности вакцинных штаммов Chlamydia psittaci на лабораторных животных

Важную роль при разработке новых и усовершенствовании имеющихся вакцинных препаратов играет правильный подбор штаммов микроорганизмов. Учитывая тот факт, что представители одного вида микроорганизмов могут различаться по своим фенотипическим признакам, на первом этапе создания вакцин необходимо проведение сравнительных исследований способности исследуемых штаммов вызывать выработку специфических антител (антигенная активность) и способности обеспечивать защиту иммунизированного организма при его инфицировании данным патогенном [2, 3].

Ранее, в ходе проведения эпизоотологических исследований в козоводческом хозяйстве неблагополучном по хламидиозу был выделен новый штамм C. psittaci «АМК-16» [4]. В результате проведенных исследований, целью которых явилось изучение биологических свойств этого штамма, было установлено, что он вызывает выработку специфических антител в высоких титрах и обладает высокими иммуногенными свойствами. Это открывает перспективу его использования в разработке новых средств специфической профилактики хламидиоза животных [5].

На следующем этапе исследований было необходимо провести сравнительные исследования по оценке антигенной активности и иммуногенности нового штамма с производственными штаммами уже применявшихся для создания средств специфической профилактики хламидиозов животных, что и явилось целью данного исследования.

Материал и методы исследований. Исследования проводили на базе лаборатории вирусных антропозоонозов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

В работе использовали следующие штаммы C. psittaci :

• -    «250» – выделен от крупного рогатого скота (инфекционный титр 10^-6,5LD 50 /0,3 ml);

• -    «РС-85» – выделен от свиньи (инфекционный титр 10^-6,5LD 50 /0,3 ml);

• -    «АМК-16» – выделен от козы, (инфекционный титр 10^-5,4LD 50 /0,3 ml).

Для изготовления эмульсионных моновакцин использовали оригинальный масло-ланолиновый адъювант [1].

Стерильность биопрепаратов проверяли по ГОСТ 28085-2013 путем их высева на питательные среды.

Безвредность моновакцин подтверждали путем постановки биопробы на белых мышах путем внутрибрюшинного введения удвоенной дозы препарата согласно ГОСТ 319262013.

Антигенную активность вакцин определяли на 16 морских свинках.

Животные были разделены на четыре группы по четыре особи в каждой. Животных первой группы иммунизировали вакциной из штамма «РС-85», морским свинкам второй группы была введена вакцина из штамма «250», третью группу животных иммунизировали вакциной из штамма «АМК-16» и четвертая группа являлась контролем. Биопрепараты животным вводили подкожно, в объеме 0,2 см3. Каждые 30 суток, после иммунизации, у всех животных отбирали пробы сывороток крови, которые в последующем исследовали в реакции связывания комплемента (РСК). Исследование проводили в течение пяти месяцев после иммунизации.

Реакцию связывания комплемента ставили с применением «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» (РОСС RU.ФВ01.Н00022) производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань).

Оценку иммуногенности испытуемых штаммов хламидий проводили в остром опыте на белых мышах. Для этого мышей иммунизировали изготовленными из каждого штамма моновакцинами. Всего было сформировано по три группы животных, каждая из которых была разделена на две подгруппы (опытную и контрольную) по 20 белых мышей. Животных одной из подгрупп каждой группы иммунизировали исследуемой вакциной. Биопрепарат вводили подкожно в объеме 0,1 см3. На 14 сутки проводили ревакцинацию. Три оставшиеся подгруппы являлись контролем.

На 30 сутки после первой прививки проводили экспериментальное заражение животных всех групп штаммами хламидий «250», «РС-85» и «АМК-16». Каждым штаммом заражали по одной группе животных. Инфекционный материал вводили внутрибрюшинно в объеме 0,1 см3. Далее, на протяжении 14 суток, фиксировали падеж животных в каждой подгруппе. Эффективность каждого биопрепарата оценивали по индексу защиты, который рассчитывался по формуле:

Где Х – индекс защиты; А – количество павших животных в контрольной группе; В – количество павших животных в иммунизированной группе.

Хламидийную этиологию гибели белых мышей подтверждали путем реизоляции хламидий на развивающихся куриных эмбрионах.

Результат исследований. На первом этапе исследования нами были сконструированы три эмульсионных моновакцины (тип эмульсии вода-масло) из штаммов «РС-85», «250» и «АМК-16».

Стерильность (отсутствие контаминации микроорганизмами) биопрепаратов была подтверждена в ходе проведения бактериологических исследований на питательных средах.

Исследование на белых мышах также подтвердило безвредность исследуемых вакцин.

Результаты оценки антигенной активности исследуемых биопрепаратов представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы все исследуемые вакцинные препараты вызывали выработку специфических хламидийных антител у иммунизированных животных. Наибольшая концентрация хламидийных антител в сыворотках крови морских свинок была выявлена на 30 и 60 сутки после иммунизации.

Для наглядности на рисунке 1 представлена динамика накопления комплементсвязывающих хламидийных антител в сыворотках крови иммунизированных морских свинок.

Таблица 1 – Антигенная активность моновакцин на основе штаммов хламидий «РС-85», «250» и «АМК-16»

Рисунок 1 – Динамика накопления специфических хламидийных антител в сыворотке крови

Вакцина на основе штамма Номер животного Титры антител в РСК 30 сутки 60 сутки 90 сутки 120 сутки 150 сутки «РС-85» 1 1:20 1:40 1:20 1:10 1:10 2 1:80 1:40 1:40 1:20 1:20 3 1:40 1:20 1:40 1:20 1:10 4 1:160 1:80 1:40 1:20 1:20 Средний титр по группе 1:80 1:70 1:45 1:35 1:17,5 «250» 5 1:20 1:40 1:20 1:10 1:10 6 1:80 1:40 1:40 1:20 1:20 7 1:40 1:20 1:40 1:20 1:10 8 1:160 1:80 1:40 1:20 1:20 Средний титр по группе 1:75 1:45 1:30 1:17,5 1:15 «АМК-16» 9 1:160 1:80 1:80 1:40 1:40 10 1:80 1:80 1:40 1:20 1:10 11 1:80 1:40 1:80 1:40 1:40 12 1:160 1:320 1:80 1:80 1:80 Средний титр по группе 1:120 1:130 1:70 1:45 1:42 Контроль 13 - - - - - 14 - - - - - 15 - - - - - 16 - - - - - Средний титр по группе - - - - - морских свинок, иммунизированных моновакцинами на основе штаммов хламидий «250», «РС-85» и «АМК-16»

Как видно из рисунка, в группах животных, иммунизированных вакцинами из штаммов «РС-85» и «250» максимальные титры антител, были выявлены на 30 сутки после вакцинации в средних титрах 1:80 и 1:75 соответственно. Далее их концентрация постепенно снижалась и на 180 сутки после введения вакцин была равна титрам 1:17 и 1:15 соответственно.

В группе животных, иммунизированных вакциной на основе штамма «АМК-16» рост титров хламидийных антител продолжался на протяжении 60 суток после вакцинации, достигнув максимального среднего титра 1:120. Далее концентрация антител постепенно снижалась, однако на протяжении всего исследования была выше, чем у животных иммунизированных вакцинными препаратами из штаммов     вакцины на основе штамма хламидий «РС-

«РС-85» и «250».                               85».

В таблице 2 представлены результаты изучения иммуногенности

Таблица 2 – Иммуногенность моновакцины на основе штамма «РС-85» в остром опыте на белых мышах

№	Подгруппа	Штамм для заражения	Животных выжило	Животных пало	Процент выживших животных	Индекс защиты
1	Иммунизированные	«РС-85»	17	3	85	4
	Контроль		8	12	40
2	Иммунизированные	«250»	14	6	70	2,6
	Контроль		4	16	20
3	Иммунизированные	«АМК-16»	15	5	75	3,2
	Контроль		4	16	20
Среднее значение индекса защиты					3,26

Анализируя результаты экспериментального заражения трех групп белых мышей, разными штаммами хламидий, было установлено, что в подгруппах животных, иммунизированных вакциной из штамма «РС-85» процент павших животных был ниже, чем в контрольных подгруппах. Что в свою очередь подтверждает факт выработки противохламидийного иммунитета у иммунизированных животных. Однако наиболее высокий индекс защиты был зафиксирован в группе белых мышей, инфицированных тем же штаммом («РС-85»), из которого был изготовлен вакцинный препарат.

Аналогичные данные представлены в таблице 2 и таблице 3.

Таблица 3 – Иммуногенность моновакцины на основе штамма «250» в остром опыте на белых мышах

№	Подгруппа	Штамм для заражения	Животных выжило	Животных пало	Процент выживших животных	Индекс защиты
1	Иммунизированные	«РС-85»	13	7	65	2,4
	Контроль		3	17	15
2	Иммунизированные	«250»	16	4	80	3,75
	Контроль		5	15	25
3	Иммунизированные	«АМК-16»	14	6	70	2,3
	Контроль		6	14	30
Среднее значение индекса защиты					2,8

Таблица 4 – Иммуногенность моновакцины на основе штамма «АМК-16» в остром опыте на белых мышах

№	Подгруппа	Штамм для заражения	Животных выжило	Животных пало	Процент выживших животных	Индекс защиты
1	Иммунизированные	«РС-85»	16	4	80	3,25
	Контроль		7	13	35
2	Иммунизированные	«250»	15	5	75	3,2
	Контроль		4	16	20
3	Иммунизированные	«АМК-16»	17	3	85	4,6
	Контроль		6	14	30
Среднее значение индекса защиты					3,6

Как видно из таблиц, в каждом случае    инфицирования    животных, иммунизированных одной из вакцин, тремя штаммами хламидий, наиболее высокий индекс защиты выявляется в группе зараженной тем же штаммом, из которого изготовлена вакцина.

Полученные результаты косвенно указывают на наличие различных иммуногенных детерминант в составе исследуемых штаммов хламидий.

Заключение.         Анализируя полученные экспериментальным путем данные, было установлено, что наиболее антигенно активным оказался штамм «АМК-16», что так же было подтверждено и при испытании иммуногенности, т.к. этот штамм (АМК-16) давал наиболее высокий индекс защиты от заражения всеми тремя штаммами.

Однако, анализируя полученные экспериментальным путем данные, было установлено, что все три исследуемых штамма хламидий отличаются друг от друга своими антигенными свойствами и обладают высокой иммуногенностью. Поэтому целесообразно в состав вакцины включить все три штамма, что значительно расширит ее антигенный спектр и сделает биопрепарат более эффективным.