Сравнительная оценка количественного определения апротинина разными методами

Апротинин – международное название антиферментного препарата, получаемого из органов (легкие и др.) крупного рогатого скота, поливалентного ингибитора протеиназ. Лекарственные препараты, содержащие в качестве действующего вещества апро-тинин, оказывают антипротеолитическое, антифиб-ринолитическое, гемостатическое действие, подавляя при патологических процессах чрезмерную активацию протеолитических ферментов (трипсина, химотрипсина, калликреина, плазмина и др.) в крови и тканях. Они эффективны для лечения и профилактики панкреатитов, различных форм шока, фибринолитических коагуалопатий. В России зарегистрированы препараты апротинина зарубежных производителей под торговыми названиями Гордокс, Траси-лол® 500000, Контрикал®, а также российских производителей – Ингитрил, Апротекс, Веро-Наркап® [1].

Активность апротинина определяют разными методами и, соответственно, выражают в различных единицах: КИЕ – калликреин ингибирующие единицы; Ph.Eur.U – трипсин инактивирующие единицы Европейской фармакопеи (1 Ph.Eur.U соответствует 1800 КИЕ); АТрЕ – антитрипсиновые единицы (1 АТрЕ соответствует 1,33 КИЕ); ЕД – единицы действия по фармакопейной статье на Ингитрил [2]. Гордокс, Трасилол, выпускаемые в виде жидких концентратов, определяют и дозируют в КИЕ. Контри-кал и российские аналоги выпускают в лиофилизированном виде. Количественное определение апро-тинина и дозирование этих препаратов (за исключением Ингитрила) проводят в АТрЕ.

Для первого отечественного препарата апроти-нина Ингитрил, разработанного в СССР, были установлены другие единицы количественного определения и дозирования. Согласно нормативному документу (ВФС 42-708-95), его выпускали по 15 ЕД в ампуле (флаконе). При внедрении Ингитрила в медицинскую практику сравнение, проведенное разработчиками препарата эмпирическим путем (биохимическими методами и определение количества апро-тинина методом ВЭЖХ), показало, что 15 ЕД Ин-гитрила (содержимое 1 ампулы или флакона) приблизительно соответствует 10000 АТрЕ (содержимому 1 флакона) Контрикала.

Томский филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «НПО «Вирион» выпускал готовую лекарственную форму Ингитрил в течение 9 лет (1999-2007 гг.) из лиофилизированного полупродукта апротинина, закупаемого у других российских производителей. Сравнительная оценка количественного определения этого препарата разными методами в тот период подтвердила, что его номинальная доза в ампуле 15 ЕД приблизительно соответствовала 10000 АТрЕ Контрикала: в параллельном исследовании пяти серий Ингитрила в 2002 г., в Институте государственного контроля лекарственных средств, их антитрип-синовая активность в ампуле составила от 9111 до 10304 АТрЕ. С 2005 г. в НПО «Вирион» начаты работы по внедрению полного технологического цикла производства Ингитрила, начиная от сырья (легких крупного рогатого скота), по собственной технологической схеме. Кроме того, в связи с рекомендациями экспертов Фармакопейного комитета поставлена задача в перспективе перейти на выпуск лекарственной формы апротинина в АТрЕ, для которой мы зарегистрировали торговую марку Контривир. Для отработки методики количественного определения активности препарата в АТрЕ с целью его дозирования в этих единицах необходимо было сравнить степень выявления апротинина разными методами в препаратах, изготовленных по собственной технологии, и других аналогах.

Таким образом, цель настоящего исследования – провести количественное определение апротинина разными методами в препаратах, изготовленных в НПО «Вирион» на разных этапах отработки собственной технологической схемы, и оценить для них в сравнении с известными аналогами соотношение между дозировками в разных единицах в расчете на массу действующего вещества.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом изучения явились экспериментальные и опытно-промышленные серии готовых препаратов апротинина (Ингитрила и Контривира) с различной дозировкой действующего вещества в ампуле, изготовленные в 2005-2008 гг. в период разработки и внедрения собственной технологической схемы полного цикла производства этого продукта из сырья (лег-25

ких крупного рогатого скота). Их сравнивали в параллельных анализах с препаратом Контрикал® (Германия), рег. № П N012371/01 и коммерческой серией препарата Ингитрил (Россия), рег. № 95/124/4, изготовленной в Томском филиале ФГУП «НПО «Микроген» «НПО «Вирион» в тот же период времени.

Экспериментальные и опытно-промышленные серии (за исключением серии № 051207) были приготовлены из лиофилизированного полупродукта апротинина, полученного в результате постадийной переработки сырья. Партии полупродукта для приготовления экспериментальной серии № 011105 были наработаны по малообъемной лабораторной технологии в течение 2005 г. Партии полупродукта апротинина для изготовления других серий были произведены в период с апреля 2007 г. по март 2008 г. по мере отработки масштабированной технологии, отличающейся от лабораторной. Лиофилизированный полупродукт, соответствующий требованиям нормативного документа (проекта спецификации), разводили водой для инъекций (ФС 42-2620-97) до расчетной концентрации, доводили рН раствора добавлением натрия гидроокиси до заданных значений, затем стерилизовали фильтрации через капсулы с конечным размером пор 0,2 мкм и разливали в ампулы соответствующей вместимости (в зависимости от дозы). Соотношение ингредиентов в растворе препарата рассчитывали на основании данных анализа удельной активности апротинина (в ЕД или в АТрЕ) в расчете на 1 г полупродукта. Расчетная концентрация действующего вещества в растворе для серий Ингитрила (и Контривира № 011105) была 30 ЕД/мл, для других серий Контривира – 15000 АТрЕ/мл. Дозу разлива препаратов устанавливали, принимая во внимания фактические аналитические значения количественного определения в приготовленном растворе, для достижения номинального значения в ампуле: для Ингитрила 15 ЕД, для Контривира 30000-35000 АТрЕ (для серии № 011105 – 60 ЕД). Серия Ингитрила № 051207 была приготовлена из жидкого полупродукта (без его промежуточной лиофилизации), который после определения удельной активности (ЕД/мл) разлили в ампулы из расчета номинальной дозы 15 ЕД. После разлива все препараты лиофилизировали по стандартной производственной технологии. Объем серий, изготовленных в 2005-м и 2007 годах, составил 1,0-2,0 л, в 2008 г. – 14 л.

Количественное определение апротинина в ЕД проводили по методике, изложенной в ВФС 42-708-95 и ФСП 42-0504-7815-06 на Ингитрил. Суть метода – определение снижения протеолитической активности трипсина при взаимодействии с препаратом апро-тинина в стандартных условиях. За единицу ингибирующего действия (1 ЕД) принимают величину, обратную наименьшему количеству препарата, необходимого для 100% торможения активности 1 г 26

трипсина при условиях определения. Протеолитическую активность трипсина выражают в тирозиновых единицах (ТЕНЬ35,5°) по Ансону (устанавливают в реакции расщепления гемоглобина при 35,5°С и рН 7,8). По вышеуказанным нормативным документам приемлемые значения для препарата Ингитрил – не менее 550 ЕД/г или среднее количественное содержание в ампуле от 13,5 до 16,5 ЕД.

Количественное определение апротинина в АТрЕ проводили по методике, предоставленной нам в 2002 г. Институтом государственного контроля лекарственных средств НЦ ЭГКЛС, аналогичной для препарата Контрикал® 10000 (НД 42-32-00). Суть метода – торможение под действием препарата ап-ротинина катализированного трипсином расщепления синтетического субстрата БАПНА (N-a-бен-зоил-аргинин-4-нитроанилида), которое измеряют по снижению образуемого из субстрата специфического продукта (4 – нитроанилина), эквивалентного активности трипсина в оптимальных условиях опыта при 25°С. Установленную в реакции расщепления хромогенного субстрата БАПНА активность трипсина выражают в протеазных единицах. 1000 АТрЕ соответствуют количеству препарата, тормозящему на 50% активность 2 протеазных единиц трипсина. В соответствии с нормативной документацией на Конт-рикал среднее содержание апротинина во флаконе должно быть от 9000 до 11000 АТрЕ.

Среднюю массу содержимого в ампуле (флаконе) определяли в соответствии с ГФ XI, вып. 2.

Определение количества действующего вещества (апротинина) в миллиграммах в ампуле (флаконе) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для проведения ВЭЖХ использовали жидкостной хроматограф высокого давления фирмы Waters (США), включающий насос для подачи подвижной фазы в системе под давлением, УФ-детектор, дегазатор, автоинжектор и компьютер с программным обеспечением Breeze, и аналитическую колонку для обращенно-фазовой хроматографии: Luna 5μ С18(2), 250х4,6 мм, (Phenominex, США). Подвижной фазой служил Буфер А (рН 2,2), представляющий собой 0,2 М раствор перхлората натрия с добавлением 10 мМ ортофосфорной кислоты, разбавленный ацетонитрилом (70:30 объем к объему) при скорости потока 1 мл/мин, время пропускания (анализа) – 35 мин. Элюент детектировали при длине волны 200 нм [3]. Пробы для анализа подготавливали следующим образом: содержимое ампул с препаратами апротинина разводили подвижной фазой (Буфер А + ацетонитрил) до концентрации 4 мг/мл, объем раствора для разведения образцов рассчитывали, исходя из средней массы содержимого ампулы каждой конкретной серии. Стандарт апротинина (Sigma, кат. № А3886) разводили до концентрации (4 + 0,2) мг/мл. Для анализа на колонку наслаивали 10 мкл пробы (около 40 мкг анализируемого препарата или стандарта апротинина).

Значения площадей целевого пика, полученные при последовательном хроматографировании проб стандарта и испытуемых препаратов, использовали для расчета количества апротинина по формуле:

V X X

X _ ПРпр St-St v np sst       , где Х – количество граммов апротинина в ампуле (флаконе) испытуемого препарата;

Sпр – площадь целевого пика на хроматограмме раствора испытуемого препарата (совпадающего по времени удерживания с основным пиком на хроматограмме стандарта);

Сst – концентрация раствора стандарта апроти-нина;

Vпр – объем разведения образца испытуемого препарата;

Sst – площадь пика апротинина на хроматограмме раствора стандарта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фактические аналитические данные количественного определения апротинина разными методами в сравниваемых препаратах представлены в таблице 1.

Для серии референс-препарата Контрикал эти данные соответствуют требованиям нормативного документа на него по содержанию апротинина во флаконе: среднее значение 9141 АТрЕ соответствует интервалу 10000±1000 АТрЕ с допустимым отклонением от номинального значения в единичном образце от 85 до 115%.

При количественном определении дозы апроти-нина в ЕД установленное для Контрикала среднее значение 15,8 ЕД было в пределах 15±1,5 ЕД во флаконе. Это согласуется с заявленным соотношением между этими единицами дозирования, полученными ранее опытным путем для препаратов апротинина: 1 ампула 15 ЕД Ингитрила равна 1 ампуле 10000 АТрЕ Контрикала [2]. Количество действующего вещества во флаконе Контрикала, установленное нами методом ВЭЖХ, равное 1,99 мг, на наш взгляд, также является приемлемым значением. Известно, что 1 флакон этого препарата (средняя масса которого в использованной нами серии составила 14,4 мг) помимо активного фармацевтического ингредиента, дозируемого в АТрЕ, содержит 10 мг вспомогательного вещества (маннитола). Известно также из данных фирмы Байер (Германия), впервые внедривших апроти-нин в медицинскую практику, что 1,4 мг этого высо-коочищенного препарата имеют специфическую активность 10000 КИЕ. Зная, что 1 АТрЕ = 1,33 КИЕ, теоретически ожидаемое содержание действующего вещества во флаконе Контрикала должно быть в среднем 1,86±0,19 мг (то есть от 1,67 до 2,05 мг). Таким образом, для этого препарата в нашей аналитической лаборатории получены удовлетворительные результаты при анализе всеми указанными методами, подтверждающие данные производителя.

Таблица 1

Сравнительные аналитические данные количественного определения апротинина в препаратах

Препарат, № серии	Срок хранения до анализа*	Средняя масса содержимого ампулы, мг	Количество апро-тинина в ампуле, мг (метод ВЭЖХ)	Количественное определение		Аналитические данные до хранения
				ЕД/амп.	АТрЕ/амп.
Экспериментальные серии
Контривир, 011105	39 мес	41,6	10,8	50,2	27693	56,8 ЕД/амп. 24904 АТрЕ/амп.
Ингитрил, 021007	15 мес	24,1	2,17	11,4	7376	12,0 ЕД/амп.
Ингитрил, 041107	15 мес	26,6	1,86	12,1	7370	13,3 ЕД/амп.
Ингитрил, 051207	15 мес	18,3	3,66	24,4	12342	24,0 ЕД/амп.
Контривир, 011207	15 мес	60,9	10,98	84,2	42643	35365 АТрЕ/амп.
Контривир, 021207	15 мес	81,9	10,64	77,2	38514	34488 АТрЕ/амп.
Контривир, 031207	15 мес	83,0	11,62	77,7	40409	32385 АТрЕ/амп.
Опытно-промышленные серии
Ингитрил, 010408	12 мес	13,0	Н.о.	17,3	9195	16,5 ЕД/амп.
Препараты сравнения
Ингитрил, 020307	24 мес	13,5	2,10	13,5	7825	14,3
Контрикал®, 8А651	Через 1 год после выпуска	14,4**	1,99	15,8	9141	Нет данных

* – Анализируемые образцы хранились при температуре от 2 до 8°С (условия хранения по нормативной документации – при температуре от 2 до 20°С); ** – в том числе 10 мг вспомогательного вещества.

Для коммерческой серии препарата Ингитрил (№ 020307), также взятой нами в качестве препарата сравнения, удовлетворительные значения были получены при количественном определении в ЕД и анализе методом ВЭЖХ. Среднее содержание апроти-нина в ампуле (для образцов на конце срока годности) составило 13,5 ЕД, а установленное методом ВЭЖХ содержание действующего вещества в ампуле – 2,1 мг. Эти значения соответствуют требованиям нормативного документа на Ингитрил, сопоставимы с паспортными данными этой серии и значениями, полученными для содержимого 1 флакона Контрика-ла. Таким образом, по результатам вышеуказанных анализов количество действующего вещества в ампуле Ингитрила серии № 020307 сопоставимо с дозой апротинина во флаконе препарата Контрикал. Результат параллельного количественного определения ап-ротинина в АТрЕ при анализе серии № 020307 составил 7825 АТрЕ/ампула, что несколько ниже теоретически ожидаемого значения 10000±1000 АТрЕ/ам-пула и аналитических данных для препарата Конт-рикал. Следовательно, сопоставимые по массе и определении в ЕД дозировки действующего вещества в этих двух препаратах оказались различными при определении в АТрЕ.

В сравнительном испытании двух экспериментальных серий Ингитрила № 021007 и № 041107 с расчетной дозой 15 ЕД количество апротинина в ампуле, установленное методом ВЭЖХ, равное 2,17 и 1,86 мг, было сопоставимо с теоретическими и фактическими аналитическими значениями, полученными для дозы препарата Контрикал. Однако при количественном определении в ЕД фактические аналитические значения среднего содержания апроти-нина в ампуле этих серий были 11,4 и 12,1 ЕД, что менее 13,5 ЕД (нижней границы норматива), но в соответствии с ранее полученными для них аналитическими данными. При определении в АТрЕ средние значения количественного содержания апротинина в ампуле этих серий (7376 и 7370 АТрЕ) также были ниже нормы 9000 АТрЕ, установленной для Контри-кала с учетом допустимого отклонения, и ниже пропорционально соответствующих теоретически ожидаемых значений (минимум должны быть 76008000 АТрЕ). Низкие результаты ингибирующей активности апротинина в готовом продукте указанных экспериментальных серий Ингитрила могут быть обусловлены тем, что они были изготовлены из партий полупродукта с удельной активностью на пределе или чуть ниже нормы, недостаточно очищенных от примесей, полученных на ранних этапах отработки технологии.

В экспериментальной серии Ингитрила № 051207, приготовленной на более поздних этапах отработки полного цикла технологии апротинина из жидкого полупродукта, фактическое аналитическое значение количественного определения его активности регламентированным методом оказалось выше расчетной 28

– 24 ЕД. При сравнительном испытании разными методами образцов на сроке хранения специфическая активность этой серии, измеренная в ЕД, осталась на том же уровне: 24,4 ЕД. Содержание действующего вещества в ампуле 3,66 мг, установленное методом ВЭЖХ, пропорционально соответствует этому значению при сравнении с соотношением таких же показателей в референс-препарате Контрикале. В то же время специфическая активность апротинина в ампуле, измеренная в АТрЕ, была меньше теоретически ожидаемой. По аналогии с референс-препаратом пропорционально соответствующее значение должно быть как минимум 16200 АТрЕ, фактические аналитические данные – среднее значение 12342 АТрЕ.

Подобные различия мы наблюдали и при исследовании экспериментальных серий препарата Конт-ривир: № 011207, № 021207 и № 031207. Сравнение аналитических значений содержания действующего вещества в ампуле этих серий, установленных методом ВЭЖХ (см. табл. 1), с аналогичными значениями для препарата Контрикал показало, что они соответствуют приблизительно 5,3-5,8 дозы референспрепарата. Фактические значения количественного определения в ЕД для этих серий (84,2; 77,2 и 77,7 ЕД/ампула, соответственно номеру серии) укладываются в теоретически ожидаемый пропорционально этим дозам допустимый диапазон от 71,6 до 95,7 ЕД/ампула. При параллельном определении активности апротинина в ампуле этих серий другим методом фактические аналитические значения (42643; 38514 и 40409 АТрЕ/ампула) были ниже теоретически ожидаемых значений для указанных доз по аналогии с Контрикалом (как минимум должно быть на уровне 47000-52000 АТрЕ/ампула). Кроме того, сопоставляя результаты количественного определения апротинина в АТрЕ экспериментальных серий Контривира, полученные на разных сроках хранения, можно отметить, что фактические аналитические значения сразу после их изготовления ниже, чем на сроке хранения 15 месяцев. Подобная тенденция была отмечена нами ранее в ходе изучения стабильности экспериментальных серий методом ускоренного старения при анализе образцов, заложенных на хранение при повышенных температурах. В то же время для экспериментальных серий Ингитрила, изготовленных по сходной технологии, но оцениваемых в ЕД, показатель количественного определения оставался стабильным при всех условиях и сроках хранения. Одной из возможных причин неадекватных результатов количественного определения в АТрЕ (ниже теоретических значений) может быть разный состав примесей в наших препаратах по сравнению с Контрикалом, которые изменяют конкуренцию между апротинином и субстратом БАПНА за активный центр трипсина и приводят к занижению результатов анализа данным методом.

Сравнительные испытания образцов с большим сроком хранения (более 3 лет) экспериментальной серии Контривир № 011105, изготовленной по лабораторной технологии (расчетная доза апротинина в ней 60 ЕД/ампула), показали, что ее специфическая активность, измеренная в АТрЕ, осталась практически на том же уровне, что и после изготовления, хотя аналитические значения в ЕД несколько снизились по сравнению с исходными (см. табл. 1). Количество апротинина при определении в ЕД в 1 ампуле этого препарата соответствует 4 дозам Контрикала, а при определении в АТрЕ – 3 его дозам. Количество ап-ротинина в ампуле, установленное методом ВЭЖХ, соответствует 5,3 дозы референс-препарата (так же как в других экспериментальных сериях Контриви-ра). Таким образом, соотношение значений количественного определения апротинина тремя этими методами для данной серии отличается от такового в экспериментальных сериях, приготовленных в 2007 г. по другой технологии. Можно предположить, что полупродукт апротинина в этой серии, несмотря на хорошую удельную активность в целом, содержит действующее вещество с меньшей функциональной активностью, чем в других сравниваемых препаратах, либо какие-то интерферирующие примеси, приводящие к неадекватным результатам в биохимических анализах.

В итоге четыре экспериментальные серии препаратов апротинина, изготовленные в ходе отработки его технологии, по удельной активности в ЕД, приходящейся на массу целевого продукта, соответствующую дозе высокоочищенного препарата Конт-рикал, сходны с этим препаратом и аналогичны коммерческой серии Ингитрила, изготовленной из закупаемого полупродукта другого производителя. Метод количественного определения в АТрЕ с высокоспецифичным для трипсина субстратом БАПНА при анализе наших экспериментальных препаратов давал значения, отличающиеся от значений, полученных при анализе таких же доз апротинина в препарате Контрикал, но сравнимые с коммерческой серией Ингитрила. При этом сами методы показывали в нашей лаборатории приемлемую повторяемость и воспроизводимость результатов (различия в пределах 10%). Использование метода количественного определения и дозирования в АТрЕ для нашего препарата апротинина возможно при усовершенствовании собственной технологической схемы с целью уменьшения примесей целевого продукта без потери при этом его активности. Следует сказать, что в опытнопромышленной серии Ингитрила № 010408, приготовленной в 2008 г. (для экспертизы в рамках регистрации разработанной технологии), параллельное количественное определение апротинина в образцах на сроке хранения 1 год (половина заявленного срока годности) выявило фактические аналитические значения в ЕД и в АТрЕ в среднем на ампулу, в соотношении, сопоставимом с таковым для референспрепарата Контрикал.