Сравнительная оценка уровня фактора роста нервов в экспериментальных моделях интерстициального цистита/синдрома болезненного мочевого пузыря

И нтерстициальный цистит/синдром болезненного мочевого пузыря (ИЦ/СБМП), является хроническим заболеванием, проявляющимся болевым синдромом, увеличением частоты мочеиспускания и наличием частых эпизодов ургентности. Это состояние трудно диагностировать, причем ряд исследователей описывает 2 отдельных расстройства: «интерстициальный цистит» как хроническое воспалительное заболевание и «синдром болезненного мочевого пузыря», в котором часто отсутствует воспалительный компонент [1-3]. По мнению Я.Б. Миркина и соавт. причиной развития ИЦ является повреждение гликозаминогликанового слоя уротелия, затем в процесс включаются другие патогенетические звенья: ЦНС, органы и мышцы малого таза [4]. При СБМП первичной причиной может быть не поражение уротелия, а нейрогенная дисфункция или хроническая ишемия мочевого пузыря.

Тем не менее, общая этиология и патофизология ИЦ/ СБМП остается неясной и может включать в себя как инфекционные, неврологические, аллергические, аутоиммунные факторы, так и токсические вещества мочи [5].

В целях лучшего понимания патофизиологии ИЦ/ СБМП созданы различные экспериментальные модели хронического цистита [6,7]. Однако они имеют определенные недостатки. Например, эффекты внутрипузырной инстилляции раздражителя или иммуностимулятора, которые были исследованы у ряда животных (морских свинок, грызунов, кроликов и кошек), демонстрируют значительную изменчивость [8].Однако большинство моделей, предложенных различными авторами эффективны [9,10].

В настоящее время актуально изучение диагностической и терапевтической значимости биомаркеров ИЦ/СХТБ в частности, фактор роста нервов (NGF). Результаты ряда исследований выявили его связь с гиперактивным мочевым пузырем и ИЦ/СБМП, что может помочь в дифференциальной диагностике этих состояний [11-14]. Известно, что в мочевом пузыре фактор роста нервов экспрессируется в клетках уротелия и гладких мышцах [15]. Сообщается, что на модели трансгенных мышей высокая степень выраженности NGF в мочевом пузыре способствовала изменениям функции мочевого пузыря [16], а также возникновению интерстициального цистита [15].

Тем не менее, роль фактора роста нервов в развитии ИЦ/СБМП, остается не ясной, а данные литературы по этому вопросу порой, противоречивы. В связи с этим, исследование уровня фактора роста в крови и моче при ИЦ/ СБМП, как диагностического биомаркера является необходимым.

Цель исследования – оценить уровень фактора роста нервов в крови и моче в различных экспериментальных моделях интерстициального цистита/синдрома болезненного мочевого пузыря для выявления оптимальной модели цистита.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование ИЦ/СБМП проведено на белых новозеландских кроликах-самках массой 1500-2000 г. При содержании животных и проведении экспериментальных исследований соблюдали правила по уходу и использования лабораторных животных (NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) и их соблюдением [17].

Моделирование ИЦ/СБМП на кроликах было создано несколькими путями, в связи с чем животных разделили на 6 групп (табл.1). Животных подвергали воздействию 70% раствора спирта, протамина сульфата, соляной кислоты (HCl), мочи, физ. раствора (NaCl). У животных I, II и III группы ИЦ/СБМП был вызван внутрипузырной инстилляцией 70% спиртовым раствором, протамин сульфат (10 мг) и HCl (0,2 мл 0,5% HCl), соответственно. У животных IV группы ИЦ/СБМП модель создана на основе одной этиологических теорий ИЦ, согласно которой к поражению гликозаминогликанового слоя приводят агрессивные свойства мочи [18]. Кроликам был сделан надлобковый разрез, после чего взятая из мочевого пузыря моча шприцем с иглой 30го калибра в объеме 0,5см3 введена под слизистую оболочку слой мочевого пузыря. Животным V группы в стенку мочевого пузыря вводили 1 мл NaCl.

Фактор роста нервов определяли твердофазным им-муноферментным методом (ELISA) с помощью набора NGF Emax®. Концентрацию NGF определяли в крови и моче. Измерения проводили через 1 и 14 дней после создания экспериментальной модели.

Статистическая обработка полученных данных проведена с помощью программ «Statistica for Windows 8.0» и «Microsoft Excel». Рассчитаны сл. показатели: среднее значение (average), стандартное отклонение среднего (Standard

Таблица 1. Группы кроликов с моделированным ИЦ/СБМП Table 1. Groups of rabbits with simulated IC / BPS

№ группы исследования № Study Group	Количество животных, n Number of animals (n)	Моделирование ИЦ/СБМП Modeling IC / BPS
1 группа 1 group	8	инъекция 70% спиртового раствора в полость мочевого пузыря injection of 70% alcohol solution into the bladder
2 группа 2 group	7	инъекция протамина сульфата в полость мочевого пузыря injection of protamine sulfate into the bladder
3 группа 3 group	8	инъекция 0,5% раствора HCl в мочевой пузырь injection of 0.5% solution of HCl in the bladder
4 группа 4 group	15	введение в стенку мочевого пузыря мочи, взятой из мочевого пузыря животного introduction into the wall of the bladder of urine taken from the bladder of an animal
5 группа 5 group	7	введение 0,9% раствора NaCl в стенку мочевого пузыря introduction of a 0.9% NaCl solution into the wall of the bladder
6 группа интактные животные 6 group intact animals	8	ничего не введено nothing entered

Deviation). Различия считали достоверными при значении p<0,05. Корреляционную зависимость между показателями в крови и моче рассчитывали по коэффициенту корреляции Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования уровня фактора роста нервов в экспериментальных группах представлены в таблице 2. Анализ концентрации фактора роста нервов в первый день исследования выявил статистически значимое повышение уровня биомаркера в крови во всех группах по сравнению с контрольной. Так, в I группе уровень NGF превышал контрольный на 46,0% (р<0,05), во II группе – на 41,0% (р<0,05), в III группе – на 60,4% (р<0,01), в IV и V группах – на 71,3 (p<0,01) и 44,0% (р<0,05). Наиболее высокий уровень повышения уровеня NGF наблюдался в IV группе животных. В этот же срок обследования уровень NGF в моче лишь в IV группе статистически значимо превышал контрольный (на 68,2%, р<0,01), в других группах различие было незначительным. Спустя 14 дней сохранялся повышенный уровень NGF в крови во всех группах по отношению к контрольной группе (р<0,05), но особенно выраженная разница отмечалась в IV группе – 90,1% (р<0,001). Концентрация NGF в моче во всех группах была выше контрольной, но статистически значимое различие наблюдалось в IV группе – 85,0% (р<0,001).

Обращала на себя внимание широкая вариабельность значений NGF в крови в первые сутки у кроликов III, IV и V групп, а в моче – в IV группе. Спустя 14 суток значительная вариабельность значений наблюдалась в крови животных I и IV групп, в моче – лишь в IV группе.

При внутригрупповом анализе уровня NGF в каждой из экспериментальных групп выявлялась следующая тенденция:

• •    в I группе наблюдения отмечалась тенденция к увеличению уровня NGF в различные сроки, причем как в крови, так и в моче. Через 14 дней после создания модели в этой группе по сравнению с начальным значением отмечалось повышение содержания NGF в крови на 35,1% (p<0,05), в моче – на 8,7%.

• •    во II группе на 14 сутки исследования отмечалось незначительное снижение уровня фактора роста нервов.

• •    в III группе концентрация NGF в крови уменьшилась на 29,3%, тогда как в моче увеличилась на 14,3%.

• •    в IV группе спустя 14 суток по сравнению с первым днем после введения мочи определялось существенное возрастание уровня NGF в крови и моче, соответственно на 65,5% (p<0,01) и 52,7% (p<0,05).

• •    в V группе отмечалось снижение концентрации NGF в крови и моче, разница с начальным сроком наблюдения в крови составила 30,8%, в моче – 30,5%.

При определении коэффициента корреляции между величинами NGF в крови и моче выявлены разнонаправленные связи (табл. 3). Сильная положительная, статистически значимая корреляция отмечалась во II группе на 14 день исследования. В контрольной группе отмечалась слабая положительная связь между величинами NGF в крови и моче.

Таблица 3. Коэффициент корреляции между показателями фактора роста нервов в крови и моче Table 3. Correlation coefficient between indicators of nerve growth factor in blood and urine

Группы	Период исследования Study period
Groups	1 сутки 1 day	14 суток 14 days
I (n=8)	+0,163	-0,088
II (n=7)	-0,219	+0,715 (p =0,05)
III (n=8) 1	+0,294	+0,415
IV (n=15)	+0,215	+0,216
V (n=7)	+0,691	-0,330
VI (n=8) |	-0,059	+0,880 ( p =0,01)

Следовательно, более выраженные изменения уровня NGF в крови и моче по сравнению с контрольной группой отмечаются в модели ИЦ/СБМП с введением в стенку мочевого пузыря мочи. Уровни NGF в крови у животных II группы коррелировали с уровнями NGF в моче. Сопоставление показателей контрольной группы с I, II, III и V группами выявило статистически значимые изменения в крови и их отсутствие в моче. При этом уровень NGF у животных с моделью ИЦ/СБМП на основе введения мочи в стенку мочевого пузыря статистически значимо отличался от показателей других вариантов моделей, а также с контактной группой. Динамическое исследование показало статистически значимые изменения концентрации NGF у животных в моделях с введением мочи в стенку мочевого пузыря.

Таблица 2. Уровень фактора роста нервов в крови и моче в группах обследования в течение эксперимента Table 2. The level of nerve growth factor in blood and urine in the examination groups during the experiment)

	Период исследования 1 сутки Study period 1 day		Период исследования 14 суток Study period 14 days
Группы	уровень HGF HGF level
Groups	кровь, нг/мл blood, ng/ml	моча, нг/мл urine, ng/ml	кровь, нг/мл blood, ng/ml	моча, нг/мл urine, ng/ml
I (n=8)	12,95±2,34 [8,5; 15,4]	9,71±0,51 [8,5; 10,5]	19,95±7,47* [14,1; 47]	10,64±0,37 [10,1;11,4]
II (n=7)	11,84±1,33 [9,4; 15,3]	11,36±2,78 [8,1; 21,1]	11,34±0,49 [10,3; 12,2]	9,34±0,55 [8,1;10,5]
III (n=8)	17,64±8,43 [10,2; 48,3]	10,51±1,06 [8,5; 13,2]	13,64±0,86 [12,1; 15,3]	12,26±1,83 [9,8;17,4]
IV (n=15)	24,33±16,30* [6,9; 68]	30,39±27,46* [9,6; 155,1]	70,62±21,63*,** [42,5; 125,8]	64,26±22,84*,** [26,4;155,1]
V (n=7)	12,47±5,02 [4,7; 21,8]	13,3±1,91 [9,6; 16,6]	9,53±0,95 [7,8; 10,9]	10,19±1,01 [8,5;12,0]
VI (n=8)	6,99±1,84 [4,3; 9,4]	9,65±0,6 [8,5; 10,7]

Примечание: * – статистическая значимость различий с 6 (контрольной) группой; ** – между сроками исследования (р<0,05-0,001) Note: * – statistical significance of differences with 6 (control) group; ** – between the periods of the study (p <0.05-0.001)

ОБСУЖДЕНИЕ

Нами рассмотрены 5 вариантов экспериментальных моделей ИЦ/СБМП, из которых 3 (I, II, III группы) – химические модели, 1 модель – введение мочи в стенку пузыря (IV группа), 1 модель с введением физ. раствора и группа с интактными кроликами. У животных всех групп исследован уровень фактора роста нервов спустя 1 и 14 дней.

Известно, что этиология ИЦ/СБМП включает воспалительные, аутоиммунные, нейротоксичные и сосудистые компоненты. Помимо этого, исчезновение гликозаминогликанового слоя из поверхностного уротелия и мочевая токсичность были предложены в качестве патофизиологических механизмов [18]. Проведенное нами исследование выявило статистически значимое повышение концентрации исследуемого NGF в крови у животных всех экспериментальных вариантов, но особенно высокий уровень определялся в группе с введением мочи в подслизистую мочевого пузыря, причем, как в крови, так и в моче. Полученные нами результаты сопоставимы с данными ряда исследователей [15]. Имеются также сообщения о повышенном уровне NGF в воспаленной ткани мочевого пузыря в моделях ИЦ на крысах [13,14].

Многие исследователи считают NGF потенциальным биомаркером ИЦ/СБМП. Установлено, что уровень NGF в моче может служить биомаркером для диагностики ИЦ/ СБМП, биомаркером в моче для дифференциальной диагностики этого заболевания и гиперактивного мочевого пузыря, а также является прогностическим фактором [13]. Следует отметить, что после сообщений, о том, что воспаление увеличивает экспрессию NGF, интерес к нему возрос, как важному показателю воспаления ИЦ/СБМП. Фундаментальные исследования показали, что воспаление вызывает нейропластичность, которая приводит к повышению уровня NGF в мочевом пузыре и генерирует ИЦ/СБМП [13]. Ряд авторов считает, что NGF играет важную роль в патогенезе ИЦ/СБМП [12,13].

Мы исследовали уровень NGF в динамике. Сравнительный анализ показал, что через 14 суток уровень NGF статистически значимо повышается в группе животных с моделью, созданной введением мочи в стенку мочевого пузыря. Заметная тесная корреляция (р=0,05) выявлялась у животных с моделью, созданной инъекцией протамина сульфата.

Наличие повышенного уровня NGF в крови и моче при ИЦ/СБМП, по-видимому, вызвано воспалительными компонентами, а выраженное повышение уровня NGF у животных с созданной моделью введением мочи в стенку мочевого пузыря обусловлено токсичностью компонентов мочи и развитием хронического воспаления.

ВЫВОДЫ