Сравнительный анализ содержания 2-макроглобулина и ассоциированного с беременностью 2-гликопротеина в сыворотке крови женщин при экстракорпоральном оплодотворении

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ

СОДЕРЖАНИЯ α ₂-МАКРОГЛОБУЛИНА И АССОЦИИРОВАННОГО С БЕРЕМЕННОСТЬЮ α ₂-ГЛИКОПРОТЕИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЖЕНЩИН ПРИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОМ

ОПЛОДОТВОРЕНИИ

*ГОУ ДПО Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей МЗ РФ; **Городская клиническая больница № 1, г. Новокузнецк

Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) – один из способов решения проблемы бесплодия. Однако несмотря на то, что в 90% случаев удается осуществить перенос эмбрионов (ПЭ), беременность наступает только у каждой третьей пациентки. Изучение причин неудач при ЭКО является актуальной задачей, решение которой не представляется возможным без получения соответствующих сведений о макроглобулинах. Макроглобулины как антипро-теолитики и иммуномодуляторы принимают участие в репродуктивной функции на этапах оплодотворения яйцеклетки, имплантации эмбрионов и в процессе вынашивания беременности [1]. Цель настоящей работы заключалась в сравнительном изучении количественных изменений в сыворотке крови женщин двух макроглобулинов – α ₂-макроглобулина (МГ) и ассоциированного с беременностью α ₂-гликопротеина (АБГ) – в раннем гестационном периоде при физиологически наступившей беременности и беременности, индуцированной ЭКО и ПЭ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В настоящем исследовании приняли участие 45 женщин в возрасте от 24 до 42 лет (в среднем 30,6 года), обратившихся в Зональный перинатальный центр г. Новокузнецка для проведения программ экстракорпорального оплодотворения, из них 15 женщин с абсолютным трубным бесплодием и 30 женщин с верифицированным диагнозом трубно-перитонеального бесплодия как следствие воспалительных заболеваний органов малого таза, т.е. острого клинического синдрома, развивающегося при восходящем инфицировании эндометрия, маточных труб и/или окружающих тканей. Формирование группы обследуемых женщин осуществлялось по критериям включения и исключения. Критериями включения считались установленная в результате ги-стерсальпингографии и/или лапароскопии трубноперитонеальная форма бесплодия, предстоящая первая попытка экстрокорпорального оплодотворения (ЭКО) и возраст пациенток не старше 42 лет. В критерии исключения входили наличие других факторов бесплодия, кроме трубно-перитонеального (эндометриоз, аномалии развития матки и др.), ЭКО в анамнезе, возраст старше 42 лет. Для обеспечения однородности изучаемых групп при оценке результатов ЭКО в критерии исключения были добавлены ненормальные показатели спермограммы, применение для обеспечения фазы десенситизации только агонистов гонадотропин-рилизинг гормона, недостаточный ответ яичников на индукцию суперовуляции (менее 4 фолликулов), отсутствие возможности переноса 3 эмбрионов, низкое качество переносимых эмбрионов GR 3,4.

Для получения объективной оценки репродуктивной функции бесплодных пар и определения рационального подхода к их ведению в программах ЭКО и ПЭ обследование пациенток до реализации программ проводилось в рамках стандартов: динамика концентраций гонадотропных и половых гормонов, клиническое и биохимическое обследования, гемо-стазиограмма, обследование и лечение инфекций, входящих в TORCH-комплекс, обследование на онко- и соматическую патологии. Выявленные нарушения корригировались. По показаниям проводилась противовоспалительная терапия, направленная на эрадикацию патогенных микроорганизмов (Сhl. trachomatis, Mic.genitalium, N.gonorrhoeae), энзимо-терапия и иммунокоррекция.

Индукцию суперовуляции осуществляли по стандартным протоколам с использованием диферелина (Ipsen, 0,1 мг) и пурегона (Organon, 100-300 МЕ) или менопура (Ferring, 2-4 мг). Забор ооцитов осуществлялся путем трансвагинальной пункции фолликулов под ультразвуковым контролем с использованием аппарата «Aloca». После подсчета количества полученных ооцитов и оценки их качества по общепринятой шкале (нормального качества – 4-5 баллов, измененные – менее 4 баллов) ооциты культивировали в 4-лу-ночных планшетах в среде IVF («Medicult», Дания) при температуре 370С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Обработку спермы проводили методом swim-up с использованием среды Sperm preparation («Medicult», Дания). Ооциты оплодотворяли через 5 часов после их пункции, добавляя 50000-100000 подвижных сперматозоидов на ооцит. Через 18-20 часов после оплодотворения ооциты исследовали на на- личие пронуклеусов на инвертируемом микроскопе при увеличении х400. Дальнейшую оценку дробления и качества эмбрионов проводили через 46-48 часов культивирования, применяя критерии Раковски на 3-и сутки развития. Перенос эмбрионов осуществлялся на 3-и-4-е сутки культивирования, в количестве 3-4 эмбрионов на 6-й-8-й клеточной стадии деления, под ультразвуковым контролем. Наступление клинической беременности оценивали через 3-4 недели после переноса эмбрионов по наличию плодного яйца в полости матки, визуализированного при УЗИ.

Клинико-биохимическое обследование пациенток включало определение содержания двух представителей семейства макроглобулинов: α ₂-макроглобулина (МГ) и ассоциированного с беременностью α ₂-гликопротеина (АБГ) в крови пациенток. Их концентрацию определяли в образцах сыворотки крови, взятой до начала проведения программы ЭКО, во время забора ооцитов путем трансвагинальной пункции фолликулов и в момент диагностики клинической беременности (на 3-й-4-й неделе после проведения эмбриотрансфера) методом ракетного иммуноэлектрофореза [2] с применением высокоспецифичных антител [3]. Содержание сывороточных макроглобулинов также было определено у 17 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста во вторую фазу менструального цикла и у 14 женщин с физиологически наступившей беременностью в сроке 3-4 недели, в возрасте 26 ± 0,1 года. Статистический анализ проводили с использованием программы Instat 2 (Sigma, США). Стандартная обработка включала подсчет средних арифметических величин (М) и их стандартных ошибок (SEM). Сравнение массивов данных осуществляли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили посредством вычисления коэффициента корреляции Спирмана (r). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание МГ в сыворотке крови обследуемых женщин

Полученные данные показали (таблица), что уровень МГ в сыворотке крови у женщин с физиологически наступившей беременностью в гестационном сроке 3-4 недели (группа 2), варьируя от 2,76 мкмоль/л до 5,79 мкмоль/л, статистически значимо не отличался от такового у здоровых небеременных женщин контрольной группы (1,45–4,28 мкмоль/л, группа 1), хотя у двух из 14 обследованных беременных пациенток были зафиксированы значения концентрации МГ, превышающие 4,28 мкмоль/л.

У пациенток с трубным бесплодием до начала проведения программ ЭКО (группы 3-1 и 4-1, таблица) сывороточное содержание МГ также не отличалось от содержания этого белка у здоровых небеременных женщин контрольной группы, как в среднем, так и по диапазону индивидуальной вариабельности. Концентрация МГ варьировала от 1,93 до 3,86 мкмоль/л у женщин 3-1 группы (отрицательный результат ЭКО) и от 1,79 до 4,55 мкмоль/л у женщин 4-1 группы (с клиническими беременностями после ЭКО). При этом 50% женщин с концентрацией МГ в крови от 2,75 мкмоль/л (2 г/л) до 4,55 мкмоль/л (3,3 г/л) забеременели в результате ЭКО, в то время как с низкой концентрацией МГ (<2,75 мкмоль/л) забеременели только 36% женщин.

Применение гонадотропинов для индукции суперовуляции привело к повышению концентрации МГ у некоторых женщин. Так, у 13 (29,5%) из 44 обследованных пациенток показатели МГ превысили 4,1 мкмоль/л (3 г/л), причем максимальные составили 6,21 мкмоль/л и 6,07 мкмоль/л соответственно в группах 3-2 и 4-2. Вследствие этого повышения в среднем уровень МГ поднялся на 25% по сравнению с предыдущим сроком обследования (от 3,01 ± 0,15 мкмоль/л, n=25 до 3,83 ± 0,16 мкмоль/л, n=44, р=0,0009), соответствуя сывороточному содержанию белка при физиологической беременности в сроке гестации 3-4 недели (р>0,05). что свидетельствует о связи уровня этого макроглобулина в крови с содержанием в организме половых стероидов.

Концентрация МГ в среднем сохранялась повышенной через 3-4 недели после переноса эмбрионов в обеих группах женщин. Независимо от исхода программы ЭКО она варьировала сходно: от 2,75 мкмоль/л до 6,07 мкмоль/л – у забеременевших женщин и от 2,48 мкмоль/л до 6,76 мкмоль/л – у незабеременевших, что соответствует индивидуальной вариабельности этого показателя у женщин с физиологически наступившей беременностью в сроке 3-4 недели. Однако в группе 4-3 у 11 (84,6%) из 13 забеременевших женщин наблюдался подъем уровня МГ приблизительно на 20% по сравнению с предыдущим сроком обследования, т.е. от 3,39 ± 0,33 мкмоль/л до 4,3 ± 0,34 мкмоль/л (коэффициент корреляции Спирмана=0,8257, р=0,0017), и лишь у двух – незначительное снижение. Отмеченный рост показателя МГ до значений, превышающих 5,5 мкмоль/л, у двух (28,6%) из 7 незабеременевших женщин из группы 3-3, по-видимому, является последствием индукции суперовуляции. У остальных пяти (71,4%) обследованных из группы 3-3 наблюдалось снижение концентрации МГ в среднем на 28% (р=0,0317), от 4,22 ± 0,32 мкмоль/л до 3,03 ± 0,22 мкмоль/л.

Содержание АБГ в сыворотке крови обследуемых женщин

Результаты показали (таблица), что уровень АБГ в сыворотке крови у женщин с физиологически наступившей беременностью в гестационном сроке 3-4 недели (группа 2), варьируя от 0,017 мкмоль/л до 0,064 мкмоль/л, статистически значимо не от- личался от соответствующего показателя у здоровых небеременных женщин контрольной группы (0,003–0,069 мкмоль/л, группа 1). Молярное соотношение МГ/АБГ у небеременных женщин варьировало от 24 до 1539, а у беременных женщин – от 54 до 174, т.е. в среднем уменьшилось в 6,5 раз (табл.). Вследствие большого диапазона колебаний индивидуальных показателей АБГ статистически значимой разницы в индексах МГ/АБГ между небеременными и беременными женщинами не было установлено, но у 9 из 15 обследованных небеременных женщин (60%) индекс МГ/АБГ превышал значение 174. Это позволяет полагать, что у большинства женщин с физиологически наступившей беременностью в гестационном сроке 34 недели все-таки наблюдается прирост количества АБГ, видимо, за счет активации его биосинтеза, что, в конечном итоге, и снижает молярное соотношение МГ/АБГ.

Нами не было обнаружено значимого различия в уровне АБГ в группах у женщин с верифицированным диагнозом трубно-перитонеального бесплодия и контрольной группы здоровых небеременных женщин (таблица). Анализ индивидуальной вариабельности результатов выявил, что концентрация АБГ колебалась от 0,003 до 0,064 мкмоль/л у женщин группы 3-1 и от 0,003 до 0,044 мкмоль/л у женщин группы 4-1, укладываясь в диапазон показателей этого белка у здоровых небеременных женщин. Показатель МГ/АБГ варьировал от 30-50 до 1042 в обеих группах, т.е. как у небеременных женщин контрольной группы.

Индукция суперовуляции гонадотропинами (группы 3-2 и 4-2, таблица) не влияла на содержание АБГ. Однако между индивидуальными показателями концентрации АБГ у женщин этих групп и до проведения программ ЭКО (группы 3-1 и 4-1) была обнаружена высокая коррелятивная связь (коэффициент Спирмана=0,7583, р<0,0001), отражающая отсутствие или однотипность изменений индивидуальных показателей. Так, у 35 из 43 женщин после индукции суперовуляции концентрация этого белка оставалась практически неизменной или обнаруживала слабый рост. Видимо, за счет последнего эффекта при росте у этих пациенток количества МГ до 3,9 ± 0,18 мкмоль/л показатель МГ/АБГ, варьируя от 45 до 1639, в среднем составил 526 ± 77, не отличаясь от такового у здоровых небеременных женщин контрольной группы. Однако у пяти из оставшихся женщин в группе 3-2 наблюдался существенный подъем уровня АБГ от 0,036–0,064 мкмоль/л (до начала проведения программ ЭКО) к 0,097–0,278 мкмоль/л (после индукции суперовуляции), в среднем от 0,05 ± 0,006 мкмоль/л до 0,14 ± 0,03 мкг/мл (р=0,0159), а молярное соотношение МГ/АБГ составило всего 24 ± 6. В группе 4-2 у оставшихся трех женщин также была зафиксирована высокая концентрация АБГ – от 0,078 мкмоль/л до 0,189 мкмоль/л (0,14 ± 0,03 мкмоль/л). Так же как у женщин из группы 3-2, у них были выявлены слабый рост или стабильность концентрации МГ и, соответственно, низкое молярное соотношение 62

МГ/АБГ (30 ± 5). В совокупности у этих восьми женщин индекс МГ/АБГ в среднем (26 ± 4) оказался значительно меньше, чем у здоровых небеременных женщин контрольной группы – более чем в 26 раз (р=0,0069), и существенно меньше, чем у женщин с физиологически наступившей беременностью – в 4 раза (р<0,0001). При этом средняя концентрация АБГ (0,14 ± 0,02 мкмоль/л) у них была выше в 3,6 раза соответствующего показателя при физиологической беременности (р<0,0001) и почти в 6 раз выше среднего показателя у здоровых небеременных женщин (р<0,0001). Таким образом, полученные результаты указывают на более активный биосинтез АБГ по сравнению с МГ после индукции суперовуляции у некоторых женщин по сравнению со здоровыми небеременными женщинами и женщинами с нормальной беременностью в сроке 3-4 недели.

Через 3-4 недели после ПЭ концентрация АБГ была определена у семи незабеременевших женщин (группа 3-3). Среди них у двух женщин она не изменилась по сравнению с предыдущим сроком обследования, у трех – снизилась на 60-70%, а у двух – повысилась в 6 раз. Соответственно, индекс МГ/АБГ у первых двух женщин снизился в 1,5 раза на фоне стабильности концентрации АБГ за счет уменьшения содержания МГ, у трех – повысился в 2,5 раза на фоне снижения концентрации обоих белков и у последних двух пациенток – снизился в 4,5 раза при повышении концентрации обоих белков. Таким образом, у четырех женщин было обнаружено уменьшение соотношения МГ/АБГ до 532 ± 238, а у трех – повышение до 1191 ± 86, т.е. до уровня здоровых небеременных женщин (р>0,05). При этом индивидуальные показатели АБГ варьировали от 0,003 мкмоль/л до 0,053 мкмоль/л, а МГ/АБГ – от 107 до 1340, т.е. находились практически в физиологическом диапазоне.

У всех забеременевших пациенток после ЭКО (группа 4-3) концентрация АБГ повысилась в среднем в 7 раз по сравнению с небеременными женщинами контрольной группы, и в 4 раза, по сравнению с уровнем при физиологической беременности. Концентрация АБГ варьировала от 0,03 мкмоль/л до 0,46 мкмоль/л, а индекс МГ/АБГ изменялся от 7 до 121 у разных пациенток. Средний его показатель был самым низким из обследованных групп, меньше, чем у небеременных женщин, почти в 14 раз, и в два раза по сравнению со здоровыми беременными женщинами (таблица).

Соотношение МГ/АБГ отрицательно коррелировало с фактом наступления беременности (r= – 0,79, р<0,0001), а между концентрацией АБГ и фактом наступления беременности корреляция была положительной (r=0,5612, р=0,01), что дополнительно указывает на тесную связь между макроглобулинами и беременностью.

Таким образом, высокая концентрация α ₂-макроглобулина (>2,75 мкмоль/л) у женщин с трубным бесплодием в программах ЭКО часто ассоциируется с наступлением клинической беременности.

Таблица

Содержание α ₂ -макроглобулина и ассоциированного с беременностью α ₂ -гликопротеина в сыворотке крови женщин при нормальной и индуцированной ЭКО беременности (мкмоль/л)

Группы обследуемых женщин	№ п/п	МГ (мкмоль/л)	АБГ (мкмоль/л)	МГ/АБГ (моль/моль)
Здоровые небеременные женщины	1	3,2 ± 0,22 (15)	0,024 ± 0,006 (15)	696,7 ± 153,3 (15)
Нормальная беременность 3-4 недели	2	3,69 ± 0,21 (14)	0,039 ± 0,004 (14)	107,52 ± 10,37 (14)
Отрицательный результат ЭКО	3-1 (до программы ЭКО)	2,9 ± 0,15 (14) рФБ=0,0051	0,025 ± 0,006 (13)	277,97 ± 91 (14) р1=0,0342
	3-2 (после стимуляции суперовуляции)	3,91 ± 0,23 (22) р1=0,0172 р3-1=0,0017	0,044 ± 0,014 (22)	380,15 ± 81,15 (22) рФБ=0,0119
	3-3 (через 3-4 недели после эмбриотрансфера)	3,94 ± 0,62 (7)	0,017 ± 0,009 (7) рФБ=0,0461	814,91 ± 187,16 (7) рФБ=0,0023 р3-1=0,0369 р3-2=0,0481
Положительный результат ЭКО	4-1 (до программы ЭКО)	3,16 ± 0,29 (11)	0,022 ± 0,005 (11) рФБ=0,0131	322,3 ± 96,5 (11) рФБ=0,0199
	4-2 (после стимуляции суперовуляции )	3,75 ± 0,23 (22)	0,035 ± 0,011 (21)	489,33 ± 115,06 (21) рФБ=0,0111
	4-3 (через 3-4 недели после эмбриотрансфера)	4,095 ± 0,32 (13)	0,17 ± 0,04 (13) р1=0,0003 рФБ=0,0004 р3-3=0,0005 р4-1<0,0001 р4-2=0,0002	49,9 ± 11,74 (13) р1=0,001 рФБ=0,0011 р3-3<0,0001 р4-1=0,0059 р4-2=0,0054

Пояснения к таблице:

Данные представлены как M ± SЕМ, где М – выборочное среднее, SEM – стандартная ошибка среднего.

р – достигнутый уровень значимости различий между данными; нижний индекс указывает номер сравниваемой группы. В круглых скобках – количество обследованных женщин.

Индукция суперовуляции гонадотропинами может сопровождаться повышением уровня обоих макроглобулинов – МГ и АБГ. Через 3-4 недели после переноса эмбрионов уровень МГ остается повышенным независимо от результативности проведенных программ. Значимый рост содержания ассоциированного с беременностью α ₂-гликопротеина в сыворотке крови регистрируется при наступлении клинической беременности, причем он существенно выше значений при физиологически наступившей беременности такого же гестационного периода.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что семейство макроглобулинов объединяет гомологичные белки, ассоциированные с беременностью. Повышение сывороточного уровня α2-макроглобулина в среднем на 50%, а ассоциированного с беременностью α2-гликопротеина в 8 раз установлено к концу I триместра нормальной гестации [4, 5]. Количественные изменения МГ в первые недели беременности прежде не исследовались, а рост сывороточной концентрации АБГ был зафиксирован при нормальной беременности в сроке 3 недели [6]. Результаты настоящей работы не выявили статистически значимых изменений количества обоих макроглобулинов в крови женщин в сроке физиологической беременности 3-4 недели, хотя было обнаружено, что уровень МГ и АБГ может повышаться у части беременных женщин в различной степени. Поскольку в среднем абсолютное количество МГ превалировало над таковым АБГ более чем в

100 раз у небеременных и в 90 раз при беременности в исследуемом сроке, доминирующий над МГ прирост количества АБГ в крови здоровых беременных женщин подтверждается анализом молярного соотношения МГ/АБГ. У беременных оно уменьшено в среднем более чем в 6 раз по сравнению с небеременными женщинами, явно указывая на более активный биосинтез АБГ, чем МГ. Видимо, благодаря этому в последующие сроки беременности уровень АБГ быстро растет, вследствие чего его абсолютное количество в III триместре беременности составляет уже 30% от такового МГ [7].

У пациенток с трубным бесплодием до начала проведения программ ЭКО сывороточное содержание МГ и АБГ практически не отличалось от такового у здоровых небеременных женщин. Однако после проведения индукции суперовуляции у части женщин наблюдалось повышение абсолютного количества МГ (у 50% пациенток) и АБГ (у 18% пациенток), а также обнаружено резкое снижение молярного соотношения МГ/АБГ, даже по сравнению с показателем при физиологической беременности. Этот факт свидетельствует о положительной связи уровня обоих макроглобулинов с содержанием в организме половых стероидов и находит подтверждение в литературе [6].

Наступившая клиническая беременность в результате ЭКО, по нашим данным, часто ассоциируется с высокой концентрацией сывороточного МГ, как исходной, до проведения программ ЭКО, так и в сроке беременности 3-4 недели. Изначально высокий уровень этого белка может являться благоприятным прогностическим признаком индуцированной ЭКО беременности у женщин с трубным бесплодием. Наше предположение подкрепляется данными других авторов. Установлено [8], что повышенный уровень МГ (1,91-2,58 г/л) в сыворотке крови после индукции суперовуляции сопряжен со сниженным риском развития синдрома овариальной гиперстимуляции. Авторы предлагают использовать низкий показатель сывороточного МГ (1,45-1,73 г/л) для прогноза формирования этого синдрома. Одним из механизмов, лежащих в его основе, может быть связывание и инактивация α ₂-макроглобулином ростового фактора сосудистого эндотелия в фолликулярной жидкости (vascular endothelial growth factor) [8]. Кроме того, показано, что количество МГ в фолликулярной жидкости преовуляторных фолликулов коррелирует с их размером [9], от которого зависит эффективный фолликулогенез и качество забираемых ооцитов.

Каких-либо данных по количественным изменениям второго макроглобулина, ассоциированного с беременностью α ₂-гликопротеина, при индуцированной ЭКО беременности нами в литературе не обнаружено. Наши исследования выявили, что такая беременность сопряжена с более высоким показателем концентрации сывороточного АБГ, чем физиологическая беременность в этом же сроке гестационного периода. Это может быть связано с допустимыми отличиями в 64

иммунной регуляции индуцированной и физиологической беременностей.

Сравнительный анализ количественных изменений двух макроглобулинов при физиологической и индуцированной ЭКО беременности, проведенный в настоящей работе, показал, что их молярное соотношение может быть более показательным параметром, чем их абсолютные концентрации. Это укладывается в рамки концепции о компенсаторных взаимоотношениях белков семейства макроглобулинов [10], структурных и функциональных аналогов, но имеющих различную степень выраженности иммунорегуляторных свойств [11], и обосновывает необходимость одновременного исследования всех макроглобулинов при изучении их роли в различных биологических феноменах.