Сравнительный аспект микробиоты кишечника телят симментальской и голштино-фризской пород методом 16S метагеномного анализа

Организм животных плотно заселен микрофлорой [1]. Нормальная микрофлора кишечника новорожденного теленка включает в себя более четырехсот разнообразных видов микроорганизмов [2, 3, 5]. В многочисленный состав микрофлоры входят бактерии, вирусы, археи, простейшие и т.д. [1, 4, 7]. Микробиота участвует в пищеварении, поддерживает связь с клетками кишечника, предотвращает влияние патогенных микроорганизмов и модулирует иммунитет [2, 4]. Численность кишечной микрофлоры зависит от целого ряда факторов-эндогенных механических, химических и факторов неспецифической резистентности [1, 2, 7]. Отмечено, что при сниженном количестве облигатной микрофлоры у телят происходит усиленный рост энтерококков, что способствует формированию эндогенного инфекционного процесса [1, 2, 4].

В последние годы все чаще прибегают к исследованию методом метагеномного анализа. Метагеномика изучает генный набор всех микроорганизмов, которые находятся в образце без выделения и культивирования [9]. Превосходством этого метода над микробиологическим, состоит в учете некультивируемых микроорганизмов, которые в свою очередь вносят вклад в разнообразие сообществ [6]. Данный метод, так же выясняет их структуру функционирования и метаболические взаимосвязи [3, 6, 9]. Во многих сообществах существует синтрофия и изучая экспрессию генов с помощью ДНК-микрочипов, можно собрать вместе куски метаболичсеской цепи [2, 6, 9]. Метагеномный анализ микробиоты кишечника показывает точный процент состава для каждого микроорганизма, их семейств, родов и вида [6]. Применение метагеномного анализа позволяет раскрыть и корректировать между микробиомом кишечника животного и болезнями, а также для диагностики на ранней стадии заболеваний [6, 9]. Поэтому изучение микробиоты кишечника является важной задачей в современной ветеринарии.

Цель: выявить наиболее устойчивую микрофлору кишечника телят от патогенных агентов в зависимости от породы, методом метагеномного анализа.

Материал и методы исследований. Исследования проводились на телятах голштино-фризской породы ТОО Костанайского района и телятах симментальской породы в ТОО Карасуского района, в возрасте 2-5 дней. Были созданы контрольная и две опытные группы по 10 голов телят в группе, в каждом ТОО района, общей численностью 60 голов. Исследовали содержимое прямой кишки новорожденных телят с помощью 16S метагеномного анализа. Перед отбором проб, обрабатывали анальное отверстие теленка теплой водой, затем тампоном, смоченным в стерильном физрастворе. Отбор проб проводили стерильной перчаткой из прямой кишки в стерильный пластиковый контейнер.

Метагеномный анализ был проведен в г. Алматы, Республике Казахстан в лаборатории химических и молекулярногенетических методов исследований ТОО «НПЦ микробиологии и вирусологии».

Методом ПЦР из полученного ДНК амплифицировали фрагмент 16S rRNA гена, размером около 600 п.н. Далее полученный ПЦР-продукт подвергали очистке с помощью магнитных бусинок Agencourt AMPure на магнитном штативе. Затем добавили универсальные индексы Illumina в ПЦР и провели повторную очистку.    Концентрацию    продукта определяли на биоанализаторе Agilent 2100. Каждый образец доводили до 4 nM концентрации и объединяли в один пул. Полученные     библиотеки     были нормализированы до концентрации 4 nМ и объединены в общий пул. Реакцию cеквенирования осуществляли с помощью программного обеспечения MiSeq™ Control Software v2.6. Пул библиотек секвенировали в приборе MiSeq (Illumina, США) с помощью набора MiSeq reagent Kit V3 (300 cycle) (Illumina, США). Таксономическая         идентификация микроорганизмов проводилась путем анализа V3 и V4 регионов 16SrRNA гена бактерий в Международной базе данных Greengenesdatabase (http://greengenes.lbl.gov/). Классификация бактерий проводилась по следующим таксономическим уровням: царство, тип, класс, порядок, семейство, род и вид. Рассматривали    микроорганизмы    в кишечнике телят на уровне рода. Генетические библиотеки готовили согласно  протоколу  16S Metagenomic

Sequencing Library Preparation (Part # 15044223  Rev. A,  Illumina, США).

Вариабельные V3 и V4 регионы 16S рРНК гена были амплифицированы с помощью универсальных праймеров с добавлением адаптеров Illumina: прямой праймер – 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAG AGACAGCCTACGGGNGGWGCAG-3′ и обратный праймер –   5′-

GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAA GAGACAGGACTACHVGGGTATCTAAT CC-3′ [8].

Анализ и обработка данных были проведены с помощью программного обеспечения MiSeq™ Reporter Software (Illumina, США).

Результат исследований. Микробный профиль бактериального сообщества кишечника телят голштино-фризской и симментальской пород на уровне Genus, представлен следующими бактериальными родами в (Таблице 1).

Микробный профиль бактериального состава кишечника 2-5дневных телят голштино-фризской породы в ТОО Костанайского района на уровне Genus представлен 16 родами. Наибольшее количество микробиоты голштино-фризской породы представлено бактерией рода Ruminococcus – 36,55 % и родом Blautia – 26,7 %. Род лактобактерий представлен родом Bifidobacterium и составляет 12,4 %. К условно–патогенным можно отнести: Escherichia 1,09 %, Clostridium 1,01 %, Serratia 0,45 %, Gemella 0,29 %, Enterococcus – 0,29 %.

Микробный профиль бактериального состава кишечника 2-5дневных телят симментальской породы в ТОО Карасуского района на уровне Genus составляет микробиом из 20 родов. Наибольшим количеством колоний, населяющих кишечник новорожденного теленка симментальской породы, является бактерия Bifidobacterium и составляет 33,81 %. Вторым по количественному составу является род Lactobacillus – 24,05 %. К условно–патогенным можно отнести: Clostridium – 1,14 % , Serratia – 2,05 % , Enterococcus – 1,45 %, Pediococcus в микробиоме кишечника телят составляет 1,93 % и может быть не только патогенной, но и пробиотическим препаратом. Collinsellа составляет у телят 1,35 %, Erysipelothrix 0,29 % , Slackia составляет в микробиоме телят 0,43 % и относится к роду Actinomycetota, семейств а Coriobacteriaceae.

Таксономический состав микробиоты фекалий 2-5-дневных телят голштино-фризской породы на уровне бактериального Species представлен 13 видами (Таблица 2).

Таблица 1 – Результаты исследования микробного профиля бактериального сообщества кишечника телят голштино-фризской и симментальской пород на уровне Genus с помощью метагеномного анализа

№ п/п     \	Род бактерий	Процент содержания в микробиоте, %
ТОО Костанайского района, голштино-фризская порода телят
1	Ruminococcus	36,66
2	Blautia	26,7
3	Bifidobacterium	12,4
4	Faecillibacterium	4,71
5	Escherichia	1,09
6	Clostridium	1,01
7	Peptophillus	0,89
8	Helioresctis	0,5
9	Serratia	0,45
10	Coprobacillus	0,4
11	Natronincola	0,39
12	Caldthrix	0,38
13	Brevibacterium	0,37
14	Peptostreptococcus	0,36
15	Gemella	0,29
16	Enterococcus	0,29
ТОО Карасуского района, симментальская порода телят
1	Bifidobacterium	33,81
2	Lactobacillus	24,05
3	Streptococcus	9,18
4	Escherichia	2,21
5	Serratia	2,05
6	Pediococcus	1,93
7	Enterococcоus	1,45
8	Collincella	1,35
9	Bacteroides	1,34
10	Clostridium	1,14
11	Blautia	1,02
12	Buleidia	0,84
13	Dorea	0,79
14	Mesoplasma	0,64
15	Sharpea	0,57
16	Slackia	0,43
17	Fructobacilus	0,34
18	Ruminococcus	0,34
19	Kocuria	0,3
20	Erysipelotrix	0,29

Таблица 2 – Результаты исследования таксономического состава микробиоты фекалий телят голштино-фризской породы на уровне Species с помощью метагеномного анализа

Вид бактерий	% содержания в микробиоте	Вид бактерий	% содержания в микробиоте
Ruminococcus gnavus	34,82	Escherichia albertii	0,95
Bifidobacterium longum	5,58	Peptoniphiius methioninivorax	0,65
Bifidobacterium scardovii	2,67	Clostridium alkalicellulosi	0,46
Bifidobacterium choerinum	0,63	Serratia entomophila	0,45
Bifidobacterium stercoris	1,49	Coprobacillus cateniformis	0,4
Bifidobacterium indoum	0,53	Brevibacterium album	0,31
Gemella cunicula	0,29	-	-

Bifidobacterium в данной микробиоте представлен следующими видами: Bifidobacterium longum – 5,58 % ,

Bifidobacterium   stercoris   –   1,49   % ,

Bifidobacterium  choerinum –  0,63  %.

Согласно литературных источников, у новорожденных в норме они составляют до 95 %. Из рассмотренной микробиоты можем выделить бактерии, которые напрямую имеют пробиотическую способность: Bifidobacterium longum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium stercoris, Brevibacterium album, Escherichia. Так же в микробиоте находятся условнопатогенные микроорганизмы: Bifidobacterium scardovii – 2,67 %, Clostridium alkalicellulosi – 0,46 %, Serratia entomophila – 0,45 %, Coprobacillus cateniformis – 0,4 %, Gemella cunicula – 0,29 %, Peptoniphiius methioninivorax – 0,65 %. В данном образце патобионты содержатся на низком уровне и в здоровой кишке теленка не вызывают проблем у животных с повышенным иммунитетом. Однако, если телята имеют низкий порог колострального иммунитета, то это дает патогенным микроорганизмам возможность вызвать различные заболевания.

Таксономический состав микробиоты фекалий 2-5-дневных телят симментальской породы на уровне бактериального Species представлен 31 видом (Таблица 3).

Таблица 3- Результаты исследования таксономического состава микробиоты фекалий телят симментальской породы на уровне Species с помощью метагеномного анализа

Вид бактерий	% содержания в микробиоте	Вид бактерий	% содержания в микробиоте
Bifidobacterium Longum	10,77	Lactobacillus taiwanensis	6,72
Bifidobacterium scardovii	6,87	Lactobacillus johnsonii	5,93
Bifidobacterium stercoris	3,65	Lactobacillus oris	2,36
Bifidobacterium choerinum	2,27	Lactobacillus antri	1,82
Bifidobacterium indicut	2,49	Lactobacillus mucosae	1,81
Bifidobacterium breve	2,1	Lactobacillus frumenti	0,42
Bifidobacterium catenulatum	0,64	Lactobacillus ultunensis	0,38
Bifidobacterium kashiwanohense	0,27	Streptococcus bovis	6,53
Serratia entomophila	2,04	Escherichia albertii	1,98
Pediococcus argentinicus	1,64	Bacteroides vulgatus	0,91
Collinsella aerofaciens	0,76	Dorea fomicigenerans	0,76
Collinsella intestinalis	0,33	Mesoplasma entomophilum	0,64
Enterococcus cecorum	0,61	Fructobacillus pseudoficulneus	0,34
Streptococcus Fryi	0,3	Sharpea azabuensis	0,56
Streptococcus vestibularis	0,58	Clostridium paraputrificum	0,29
Erysipelothrix muris	0,28

Микрофлора кишечника симментальских телят имеет большой состав молочно-кислых бактерий семейства Lactobacillaceas, Fructobacillus pseudoficulneus. А так же, облигатной микрофлорой: Bifidobacterium, Bacteroides, Streptococcus, Pediococcus argentinicus, Escherichia albertii, Collinsella intestinalis. Условно-патогенная микрофлора представлена: Enterococcus cecorum, Collinsella aerofaciens, Clostridium paraputrificum, Erysipelothrix muris.

Проведя анализ микробного профиля бактериального состава кишечника телят голштино-фризской и симментальской пород, мы выявили, что животные имеют различия в составе микробиоты. Так, телята симментальской породы имеют наиболее широкий состав микробного профиля в кишечнике по сравнению с микробиотой кишечника телят голштино-фризской породы. У симментальской породы выявлены бактерии рода Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Collinsella, Bacteroides, Dorea, Sharpea, Slackia, Fructobacillus, Kocuria, Erysipelothrix, Bulleidia, а у голштино-фризкой породы они отсутствуют. В свою очередь, у голштино-фризкой породы присутствуют в микробиоте следующие рода: Faecalibacterium, Peptoniphilus, Heliorestis, Peptoniphilus, Heliorestis, Coprobacillus, Natronincola, Caldithrix, Brevibacterium, Peptostreptococcus, Gemella, а у симментальской породы эти рода отсутствуют в микробиоте.

В составе микрофлоры кишечника телят симментальской породы превалируют бактерии рода Bifidobacterium 33,81 %, что на 21,41 % больше, чем в составе микробиоты у голштино-фризской породы (12,4 % ). Так же, в микробиоте у симментальской породы в сравнении с голштино-фризской породой в большем количестве находятся следующие рода: Escherichia на 1,12 % , Clostridium на 0,13 % , Serratia на 1,6 % , Enterococcus на 1,16 % . В составе микрофлоры кишечника телят голштино-фризской породы превалируют бактерии рода Ruminococcus – 36,55 % , что на 36,21 % больше, чем у симментальской породы. Blautia составляет 26,7 % , что больше на 25,68 % . Из условно- патогенных родов в микрофлоре симментальской породы стоит отметить – Enterococcus cecorum, Collinsella aerofaciens, Clostridium paraputrificum, Erysipelothrix muris , Pediococcus в микробиоме кишечника телят составляет 1,93 % и может быть не только патогенной, но и пробиотическим препаратом. У голштино-фризской породы наибольшая численность условнопатогенных бактерий превалирует над молочнокислыми и облигатными и представлены видами: Ruminococcus gnavus, Bifidobacterium scardovii, Escherichia albertii, Coprobacillus cateniformis, Peptoniphiius methioninivorax, Gemella cunicula.

Известно, что состав микробиоты напрямую зависит от кормления животных, полового различия, возраста, иммунитета, от материнского состояния, которое она передает при родах теленку. Анализируя микробный профиль бактериального состава кишечника телят можно сказать, что телята голштино-фризской породы наиболее подвержены желудочнокишечным заболеваниям, чем телята симментальской породы.

Заключение. Проведя анализ микробного профиля бактериального состава кишечника телят голштино-фризской и симментальской пород, установили различия в составе микробиоты. По результатам исследования сделано заключение, что телята симментальской породы имеют наиболее широкий состав микробного профиля в кишечнике по сравнению с микробиотой кишечника телят голштино-фризской породы. У голштино-фризской породы наибольшая численность условнопатогенных бактерий превалирует над молочнокислыми и облигатными. Согласно метагеномного анализа, телята голштино-фризской породы наиболее подвержены проникновению патогенной микрофлоры, чем телята симментальской породы.

В статье приводятся исследовательские результаты в сравнительном аспекте микробиоты кишечника телят симментальской и голштино-фризской пород, в возрасте 2-5 дней, при помощи 16S метагеномного анализа. По результатам исследования сделано заключение, что телята симментальской породы имеют наиболее широкий состав микробного профиля в кишечнике по сравнению с микробиотой кишечника телят голштино-фризской породы. У голштино-фризской породы наибольшая численность условно-патогенных бактерий превалирует над молочнокислыми и облигатными. Согласно анализа, телята голштино-фризской породы наиболее подвержены проникновению патогенной микрофлоры, чем телята симментальской породы.