Стимуляция мезенхимальных стволовых клеток и костномозгового гемопоэза с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при дезадаптации организма

Адаптация организма к действию экстремальных факторов включает в себя сложный механизм, включающий в себя слаженную работу ключевых гомеостатических систем (нейроэндокринная, иммунная, кроветворная и др.). В зависимости от силы экстремального воздействия или патологического процесса, наблюдается повышение общей устойчивости организма или ее снижение. Причем переход от одного состояния к другому может иметь колебательную форму [9, 4, 5, И, 1]. Особая роль в данном механизме принадлежит мезенхимальным стволовым клеткам (МСК) [5, 8, 14, 16]. Именно им также принадлежит важная роль в формировании специфического микроокружения многих органов, включая костный мозг. Они являются основной матричной единицей, так называемых «ниш», которая регулирует процессы пролиферации и дифференцировки, окружающих мезенхимальный элемент, стволовых клеток других гистогенетических линий, в частности гемопоэтических прекурсоров [17, 20]. В свою очередь гемопоэтические стволовые клетки дают начало более дифференцированным потомкам миелопоэза, эритропоэза и тромбоцитопоэза, из которых формируются клетки крови [7, 13]. Дисбаланс в работе МСК и гемопоэтических клеток-предшественников под действием стрессора сопровождается уменьшением общего количества кариоцитов, в результате чего развиваются лейкопения и (или) анемия и, как следствие, снижение резистентности организма к действию неблагоприятных факторов [5, 13]. С теоретических позиций для борьбы с этим патологическим процессом можно использовать разного рода ростовые факторы, стимулирующие гемопоэз, включая цитокины, интерлейкины, колониестимулирующие факторы и т.п. [6, 10]. С этих позиций большой интерес представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), который является естественным ростовым фактором для миелопоэза как на уровне кроветворных клеток-предшественников, так и их более дифференцированных потомков - нейтрофилов и моноцитов. Кроме того, Г-КСФ может мобилизировать МСК из костного мозга в кровь. Однако эти работы касаются преимущественно заболеваний со стороны сердечно-сосудистой системы. Интегральное воздействие данного цитокина на мезенхимальные и гемопоэтические стволовые клетки костного мозга при стрессе остается неясным [6, 10, 18, 3].

В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение роли действия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на мезенхимопоэз и миелопоэз при действии на организм экстремальных факторов.

Материалы и методы. Опыты были проведены на 55 самцах мышей линии Balb\c массой 18-21 г. Животные в общепринятых условиях и стандартной диете. В опыты отбирались только здоровые животные, прошедшие двухнедельный карантин в условиях вивария. Все манипуляции с лабораторными животными осуществляли согласно существующей Хельсинской декларации.

Иммобилизационный стресс (ИС) вызвали путем фиксации животных на спине в течение 12 часов как было описано ранее [5]. Контрольных животных содержали по 10-12 особей в обычных клетках.

В качестве Г-КСФ мы использовали рекомбинантный фармакологический препарат «Граноцит» фирмы «Aventus», который вводили подкожно в дозе 50 мкг/кг в течение 3 суток после иммобилизации [16].

На 1, 3, 5, 7 и 10 сутки после иммобилизации в периферической крови определяли содержание общего количества эритроцитов, лейкоцитов, с подсчетом лейкоцитарной формулы [12]. На 3, 5, 7 и 10 сутки часть животных забивали, подсчитывали общую клеточность костного мозга, делали миелограмму и культивировали клетки в системе in vitro. Определение общего количество мезенхимальных стволовых клеток осуществляли по стандартной методике [12]. Костный мозг вымывали из бедренной кости с помощью шприца средой DIMEM, доводили общее количества жизнеспособных кариоцитов до 1х106/мл в полной культуральной среде (ПКС), которая состояла из: 90 % среды DI МЕМ, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 200 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина (все реактивы фирмы «Sigma», США). Клетки разливали в 50 мл пластиковые флаконы фирмы «Falcon» (по 5 мл на флакон) и инкубировали при 37 °C, 100 % влажности, 5 % СО2 в течение 3 суток в СО2-инкубаторе. Затем удаляли не адгезирующие клетки и меняли полную питательную среду на свежую порцию. Материал культивировали в течение 14 суток с заменой полной питательной среды каждые 3 суток при 37 °C, 100 % влажности, 5 % СО2 в течение 3 суток в СО2-инкубаторе. После чего с помощью инвертоскопа подсчитывали число выросших колоний (агрегатов, содержащих более 50 клеток) с последующей окраской азур-П эозином [12].

Гранулоцитарные колониеобразующие клетки костного мозга исследовали по общепринятой ме- тодике путем культивирования в полутвердом бак-тоагаре фирмы «Difco» (США), 35 мм чашках Петри фирмы «Falcon» при 37 °C, 100% влажности, 5 % СО2 в течение 7 суток в СО2-инкубаторе. В полную культуральную среду дополнительно добавляли 0,3 % бактоагара и препарат «Граноцит» в дозе 10 мкг/мл. На 7 сутки подсчитывали общее количество колоний и кластеров (колонии агрегаты, содержащие более 50 клеток, кластеры от 3 до 50) с последующим извлечением отдельных колоний и окраской их азур-П эозином [12].

Статистическую обработку полученных данных проводили с вычислением t-критерия Стьюдента при помощи компьютерной программы «Statistica 7» с определением М - выборочное среднее, m - ошибка среднего и р - достигнутый уровень значимости.

Результаты и обсуждение

В результате проведенных исследований было установлено, что иммобилизационный стресс вызывает развитие лейкоцитоза на 1 сутки опыта. При этом наблюдалось развитие нейтрофилеза (на 175,3 ± 12,1 % от фона, Pt < 0,05) и лимфопения (до 43,8 ± 5,3 % от фона, Pt < 0,001), затем сменяется лейкопенией, которая продолжается до 5 суток. К 10 суткам эксперимента общее количество лейкоцитов нормализуется (табл. 1).

В костном мозге наблюдается падение общего количества миелокариоцитов (ОКК), начиная с 1 по 5 сутки опыта, которое возрастает на 7 день, а затем возвращается к исходным величинам (10 сутки) (см. табл. 1). Содержание гранулоцитомакрофагальных колоние-и кластеробразующих единиц (ГМ-КОЕ, ГМ-КлОЕ) при иммобилизаци-онном стрессе снижается на 1,3 сутки, после чего наблюдается их гиперплазия (5,7 сутки) и последующая нормализация к 10 дню исследования до исходных параметров (табл. 1). Общее количество МСК снижается на 1 сутки опыта, после чего их количество достоверно увеличивается к 3,5,7 суткам, а на 10 день возвращается к исходным вели-

Таблица 1

Динамика общего количества лейкоцитов (ОКЛ) в периферической крови, общее количество кариоцитов (ОКК), количество ГМ-КОЕ, ГМ-КлОЕ, МСК в костном мозге мышей линии Balb\c до и после 12-часовой иммобилизации (X±m, Pt)

Время после иммобилизации	ОКЛ, х109/л	ОКК в костном мозге, х109/л	ГМ-КОЕк, хЮ6	ГМ-КлОЕк, хЮ6	МСК, хЮ6
Контроль	23,3 ± 1,3	18,7 ±0,1	10,5 ±0,3	54,3 ± 1,7	1,4 ±0,1
1 сутки	27,7 ± 0,5 <0,05	11,5 ±0,5 < 0,001	4,3 ±1,7 < 0,001	31,5 ±2,3 < 0,001	0,3 ±0,1 <0,01
3 сутки	16,5 ±0,9 <0,05	13,4 ± 1,3 <0,01	5,1 ±0,7 < 0,001	35,1 ±4,1 <0,01	2,1 ±0,3 <0,05
5 сутки	17,8 ±2,1 <0,05	15,3 ±0,5 <0,05	16,2 ± 1,5 <0,05	66,1 ±2,1 <0,05	3,5 ± 0,5 <0,01
7 сутки	18,1 ±3,3 >0,05	23,1 ± 0,3 <0,05	15,6 ±0,3 <0,01	69,9 ± 1,1 <0,05	1,9 ±0,3 >0,5
10 сутки	22,9 ± 3,7 >0,5	19,3 ± 0,9 >0,5	11,5 ± 1,3 >0,5	55,9 ±3,1 >0,5	1,5 ±0,5 >0,5

Проблемы здравоохранения

чинам (табл. 1, рис. 1). Эти данные свидетельствуют о том, что при стрессе в костном мозге после общей супрессии кроветворения и мезенхимопо-эза, наблюдаемой со стороны МСК и ГМ-КОЕ, ГМ-КлОЕ, происходит последовательный запуск регенераторного механизма, который направлен сначала на восстановление микроокружения костного мозга за счет мезенхимальных клеток, а затем -кроветворной ткани на уровне гемопоэтических прекурсоров и их дифференцированных потомков.

Рис. 1. Фрагмент мезенхимальной колонии, выросшей на 14 сутки культивирования в системе in vitro из клеток костного мозга мышей линии Balb/c на 7 сутки после иммбилизации. Фазовоконтрастная микроскопия, ув. 400х.

Введение Г-КСФ животным во время иммобилизации нивелирует негативные изменения как со стороны мезенхимальных, так и гранулоцитомакрофагальных стволовых клеток, а также состояние костномозгового кроветворения и картины крови. При этом резкого падения числа со стороны исследуемых родоначальных клеток стромы и миелопоэза практически не происходит (табл. 2). Установлено, что препарат «Граноцит» оказывает протекторное действие на систему крови и элементы, формирующие микроокружение костного мозга - МСК. Количество МСК в костном мозге возрастает на 5 сутки более чем в 7 раз (см. табл. 2). При этом уже к 5 суткам опыта у животных нормализуется общее количество лейкоцитов в крови и ОКК костного мозга, после чего наблюдается выраженная гиперплазия данного органа (7 сутки опыта) (см. табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что Г-КСФ оказывает прямое стимулирующее действие на клетки белой крови, начиная с миелоидных прекурсоров, а также их более дифференцированных потомков - миелока-риоцитов костного мозга и лейкоцитов крови. При стрессе, вызванном иммобилизацией лабораторных животных, данный цитокин тоже оказывает не только протекторное, но и выраженное стимулирующее влияние на миелопоэз как на уровне ка-риоцитов костного мозга, так и их недифференцированных клеток-предшественников, включая мезенхимальные прекурсоры (см. табл. 2).

Раннее на модели цитостатической аплазии костного мозга нами было показано, что Г-КСФ не оказывает прямого стимулирующего действия на МСК [2]. Этот механизм, скорее всего, носит опосредованный характер. Очевидно, данный цитокин может активировать костномозговое кроветворение и через другие механизмы, например, с участием клеток эндотелия или других типов стромальных клеток [19, 15]. В результате чего, можно полагать, и происходит восстановление и даже активация процессов пролиферации и дифференцировки МСК (см. табл. 2).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что стресс, вызванный 12-часовой иммобилизацие, приводит к развитию дезадаптации костномозгового кроветворения как на уровне гемопоэтических, так и мезенхимальных стволо-

Таблица2 Динамика общего количества лейкоцитов (ОКЛ) в периферической крови, общее количество карицоцитов (ОКК), количество ГМ-КОЕ, ГМ-КлОЕ, МСК в костном мозге мышей линии Balblc до и после 12 часовой иммобилизации на фоне введения препарата «Граноцит» (X ±m, Pt)

Время после иммобилизации + «Граноцит» ОКЛ, х109/л ОКК в костном мозге, х 109/л ГМ-КОЕк, хЮ6 ГМ-КлОЕк, хЮ6 МСК, хЮ6 Контроль (без введения «Граноцита» 23,3 ± 1,3 18,7 ±0,1 10,5 ± 0,3 54,3 ± 1,7 1,4 ±0,1 1 сутки 28,9 ± 1,1 <0,05 14,3 ± 0,7 < 0,001 4,9 ± 1,7 < 0,001 39,5 ± 3,7 < 0,001 0,5 ± 0,3 <0,01 3 сутки 21,1 ±0,5 >0,05 13,4 ± 1,3 <0,01 9,1 ±0,7 >0,05 49,6 ± 5,3 <0,01 3,7 ± 0,2 <0,01 5 сутки 25,8 ± 1,1 <0,05 15,3 ±0,5     ' <0,05 18,2 ± 1,5 <0,05 70,1 ± 2,5 <0,05 3,5 ± 0,5 <0,01 7 сутки 27,1 ± 2,5 >0,05 25,3 ± 0,9 < 0,05 17,3 ±0,1 <0,05 65,7 ± 1,9 <0,05 2,5 ± 0,3 <0,05 10 сутки 23,5 ± 2,9 >0,5 20,1 ± 1,3 >0,05 12,3 ± 1,1 >0,5 61,9 ±3,1 >0,5 1,9 ±0,3 >0,5 вых клеток. При этом после кратковременного лейкоцитоза наблюдается депрессия лейкопоэза и снижение общего количества миелокариоцитов в костном мозге. Введение Г-КСФ при действии экстремальных факторов оказывает защитное действие на кроветворение. При этом стимулирующее влияние данного цитокина на пул мезенхимальных стволовых клеток носит, по-видимому, опосредованный характер. Его целесообразно использовать не только как фармакологический препарат при лечении лейкопении, лейкозов после химиотерапии или введения цитостатиков, но и как профилактическое средство лицам, подверженным частым стрессам и десинхронозам.