Структурно-функциональная характеристика коры сенсомоторной области мозга крыс после многократных аудиогенных судорожных пароксизмов и применения иммуносупрессивных доз циклофосфана
Автор: Ерениев С.И., Семченко В.В., Степанов С.С.
Журнал: Вестник Омского государственного аграрного университета @vestnik-omgau
Рубрика: Ветеринарные науки
Статья в выпуске: 2 (30), 2018 года.
Бесплатный доступ
Светооптическими, гистохимическими и электронно-микроскопическими методами изучено влияние аудиогенных эпилептиформных судорожных пароксизмов и иммуносупрессивных доз циклофосфана на клеточный состав, кровеносные сосуды и межнейронные контакты сенсомоторной коры мозга крыс линии Крушинского - Молодкиной с генетически детерминированным низким порогом судорожной активности мозга. Установлено, что после 15-кратных редких (через 2 дня на третий) судорожных пароксизмов увеличивалось число гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней, гипер- и гипохромных нейронов, глиальных клеток в слоях III-IV; уменьшались число капилляров на 1 мм2нейропиля и длина функционально активных кровеносных капилляров в мм/мм3в слоях I-III; снижалась численная плотность синапсов в слое I за счет симметричных и асимметричных, плоских, средних и мелких межнейронных контактов, увеличивалось количество очень мелких, крупных и очень крупных синапсов. Преобладали контакты с высотой плотных проекций > 60 нм...
Крысы линии крушинского - молодкиной, аудиогенные судороги, циклофосфан, сенсомоторная кора, цито-, ангио-, синаптоархитектоника
Короткий адрес: https://sciup.org/142216221
IDR: 142216221
Текст научной статьи Структурно-функциональная характеристика коры сенсомоторной области мозга крыс после многократных аудиогенных судорожных пароксизмов и применения иммуносупрессивных доз циклофосфана
Судорожные эпилептические припадки у человека и эпилептиформные судорожные пароксизмы у животных приводят к деструкции нервных и глиальных клеток, повышению проницаемости гематоэнцефалического и гематоликворного барьеров, проникновению мозговых антигенов в кровеносное русло, контакту мозговых антигенов с органами иммуногенеза и проникновению антител мозгоспецифической направленности в нервную ткань и ликвор. Взаимодействие антител и мозговых антигенов влияет на обменные и нейромедиаторные процессы в мозге, нарушает локальный кровоток в больших полушариях, ухудшает репаративные процессы в нервной ткани. Фиксация антител к антигенам мозга на нейронах, глиальных клетках, миелиновых оболочках, клетках эпендимы, стенках сосудов, пре- и постсинаптических мембранах сопровождается высвобождением гистамина, серотонина, брадикинина и других биологически активных веществ, влияющих на сосудистую стенку, также повышающих проницаемость гематоэнцефалического барьера [1]. В связи с этим представляет интерес влияние иммуносупрессивных доз циклофосфана на качественные и количественные показатели цито-, ангио- и синаптоархитектоники коры сенсомоторной области мозга при судорожных пароксизмах в эксперименте.
Материалы и методы
Для экспериментов использовали половозрелых крыс линии Крушинского ‒ Молодкиной (К‒М) (n = 48) с генетически детерминированным низким порогом судорожной активности мозга, все особи которой на дозированный звуковой эпилептогенный раздражитель отвечают эпилептиформными судорожными пароксизмами, предоставленных виварием лаборатории физиологии и генетики поведения кафедры высшей нервной деятельности биолого-почвенного факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Экспериментальные группы: группа сравнения I – интактные животные (n = 16), группа сравнения II (аудиогенные судорожные пароксизмы) (n = 16), основная группа (аудио-генные судорожные пароксизмы + циклофосфан) (n = 16). Материал для исследования забирали на 45-е сутки эксперимента. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом путем декапитации. Опыты проводились в соответствии с приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. и № 701 от 27.07.78 г. об обеспечении принципов гуманного обращения с экспериментальными животными.
Аудиогенные судорожные пароксизмы вызывали дозированными звуковыми стимуляциями (ЗС) интенсивностью 86 дБА (ПДУ – 80 дБА). ЗС предъявляли 1 раз в сутки 15-кратно через двое суток на третьи. Реакцию животных на шумовой раздражитель оценивали по методу Л.В. Крушинского [2] в звукоизолированной прозрачной камере (40 х 60 х 50 см), позволяющей вести визуальное наблюдение за двигательной активностью и психосоматическим состоянием животных.
В качестве иммуносупрессора использовали внутрибрюшинное введение цик-лофосфана (1,5 мг/кг массы тела в сутки) за 1 час до предъявления аудиогенного раздражения. Циклофосфан в дозе 1‒4 мг/кг обладает иммунодепрессивным действием [3], снижает судорожную активность мозга [4], уменьшает выраженность клеточного иммунитета по отношению к мозговым антигенам [5].
Сосуды окрашивали гематоксилин-эозином. Численную плотность функционально активных капилляров в слоях I‒III коры сенсомоторной области мозга крыс определяли на криостатных срезах толщиной 12 и 20 мкм, окрашенных на щелочную фосфатазу свинцовым методом по Гомори. При данной окраске выявляются функционально активные капилляры. Количество открытых концов капилляров подсчитывали под световым микроскопом МБИ-4 (окуляр 10, объектив 20) в 320 квадратах окулярной сетки, площадь которых определялась с использованием окулярного винтового микрометра МОВ-1-15х и объектмик рометра ОМП. Вычисляли плотность концов капилляров на площади 1 мм2 и длину капилляров в мм/мм3 вещества мозга.
Морфометрически численную плотность нейронов, глиоцитов, гипо- и гиперх-ромных нейронов, гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней в слоях I‒III коры больших полушарий головного мозга определяли на срезах, окрашенных ти-онином по Нисслю. Для определения численной плотности нервных и глиальных клеток в 1 мм3 коры больших полушарий использовали модифицированный метод Аbercrombie [6]. Вычисляли глио-нейронный индекс.
Для электронно-микроскопического исследования сенсомоторную кору головного мозга крыс (поле Fpa и Fpp) фиксировали погружением в смеси 1 %-ного раствора глютарового альдегида и 4 %-ного раствора параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5 %). Затем материал отмывали в фосфатном буфере в течение 1 ч, дофиксировали в 1 %-ном растворе четырехокиси осмия в течение 2 ч, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и арал-дита. Тангенциальные ультратонкие срезы коры контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Осмированный материал использовали для качественной и количественной оценки состояния нейронов и их отростков, синапсов, глиоцитов и кровеносных сосудов.
Парамембранные специализированные образования пре- и постсинаптической частей системы субсинаптических единиц (ССЕ): плотные проекции (ПП), постсинаптическое уплотнение (ПУ) и синаптическую щель оценивали на контрастированном в 1 %-ном растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) на абсолютном спирте (100 %) материале [7; 8]. Ультратонкие срезы изучали и фотографировали на электронном микроскопе ЭМВ-100 АК. На полученных электроннограммах определяли общую численную плотность синапсов на 100 мкм2 нейропиля, содержание симметричных, асимметричных и сочетанных синапсов, плоских и искривленных синапсов. Кроме того, оценивали высоту ПП (типы А, В, С), длину активной зоны контакта (АЗК), площадь АЗК, площадь свободной от АЗК поверхности шипика (СПШ), отношение СПШ/АЗК, суммарную длину АЗК на 100 мкм2 нейропиля. Случайным образом выбранные участки среза фотографировали при стандартном увеличении ×15000. Обработку материала проводили на цифровых изображениях с помощью программы ImageJ 1.46.
Статистический анализ полученного материала проводили с использованием стандартного пакета прикладных статистических программ STATISTICA-6 [9]. Проверку статистических гипотез проводили с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Нулевая гипотеза отвергалась при p < 0,05.
Результаты исследований
После многократных пороговых ЗС без использования циклофосфана по сравнению с контрольными животными увеличивалось содержание гипер- и гипохромных нейронов, гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней, численная плотность глиальных клеток в слоях III‒IV коры сенсомоторной области. Глио-нейронный индекс превышал контрольный показатель (табл. 1). Численная плотность функционально активных капилляров в верхних слоях коры сенсомоторной области по сравнению с контролем уменьшалась (табл. 2).
Таблица 1
Клеточный состав и численная плотность нейронов в 1 мм3 слоев III‒IV коры сенсомоторной области мозга крыс линии К‒М после пороговых звуковых стимуляций и применения циклофосфана, M ± m
Показатель |
Группа животных |
||
Интактные (n = 16) |
15-кратные ЗС (n = 16) |
15-кратные ЗС и циклофосфан (n = 16) |
|
Общее число нейронов |
74 300 ± 6100 |
64047 ± 5250 |
72 353 ± 5940 |
Сморщенные гиперхромные нейроны и клетки-тени |
2155 ± 177 |
19 606 ± 1610* |
12 752 ± 1047* |
Гипер- и гипохромные нейроны |
8916 ± 732 |
38 339 ± 3148* |
17 832 ± 1105* |
Глиальные клетки |
97 298 ± 2477 |
131 264 ± 2831* |
91 106 ± 2371 |
Глио-нейронный индекс |
1,31 |
2,05 |
1,26 |
Примечание . В табл. 1‒6 символ (*) означает, что в сравнении с контролем различия статистически значимы при p < 0,05 (t-критерий Стьюдента для независимых выборок). АЗК – активная зона контакта; ПП – плотные проекции; СПШ – свободная поверхность шипика. Материал представлен как среднее (M) ± стандартная ошибка средней (m).
Таблица 2
Численная плотность функционально активных капилляров в слоях I‒III коры сенсомоторной области мозга крыс линии К‒М после пороговых звуковых стимуляций и применения циклофосфана, M ± m
Показатель |
Группа животных |
||
Интактные (n = 16) |
15-кратные ЗС (n = 16) |
15-кратные ЗС и циклофосфан (n = 16) |
|
Число капилляров на 1 мм2 |
228,7 ± 8,7 |
160,9 ± 9,9* |
250,9 ± 10,1 |
Длина капилляров в мм/мм3 |
457,4 ± 13,4 |
321,8 ± 19,8* |
501,8 ± 20,2 |
В молекулярном слое коры сенсомоторной области численная плотность синапсов по сравнению с контролем уменьшалась (табл. 3). Редукция числа синапсов происходила за счет равномерного уменьшения количества симметричных и асимметричных контактов. При этом количество искривленных синапсов не отличалось от контрольного, а их относительное содержание увеличивалось. Преобладали мелкие и крупные контакты, увеличивалось относительное и абсолютное количество очень мелких и очень крупных контактов и относительное количество крупных контактов, простых перфорированных и сочетанных множественных синапсов. Уменьшалось содержание мелких и средних контактов (табл. 4). Увеличивалось относительное содержание синапсов с высокими ПП, и уменьшалось количество синапсов со средней высотой ПП (табл. 5). Площадь АЗК и свободной от АЗК поверхности шипиков по сравнению с контролем также увеличивалась (табл. 6). В части аксо-шипиковых синапсов отмечалось расширение мешочков шипикового аппарата.
При сочетании пороговых ЗС с введением циклофосфана численная плотность нейронов в слоях III‒IV сохранялась на близком к контрольному уровне (табл. 1). Число гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней, гипер- и гипохромных нейронов было меньше, чем при ЗС без применения циклофосфана. Не происходило увели- чения численной плотности глиальных клеток и глио-нейронного индекса. Отмечалась высокая сохранность ультраструктурных образований нервных клеток и глиоцитов.
Таблица 3
Численная плотность контактов с различной организацией системы субсинаптических единиц в молекулярном слое коры сенсомоторной области мозга крыс линии К‒М после пороговых звуковых стимуляций и применения циклофосфана (ФВК-метод), M ± m
Показатель |
Группа животных |
||
Интактные (n = 16) |
15-кратные ЗС (n = 16) |
15-кратные ЗС и циклофосфан (n = 16) |
|
Число синапсов на 100 мкм2 нейропиля: всего асимметричных симметричных плоских искривленных |
17,69 ± 0,41 14,54 ± 0,28 3,15 ± 0,20 5,88 ± 0,42 8,66 ± 0,17 |
12,7 ± 0,32* 10,56 ± 0,51* 2,14 ± 0,11* 4,18 ± 0,20* 8,52 ± 0,42 |
15,2 ± 0,38* 12,55 + 0,57 2,65 ± 0,16 6,62 + 0,31* 8,58 + 0,32 |
Диаметр АЗК, нм |
372,8 ± 34,3 |
445,7 ± 26,4 |
469,8 + 33,3 |
Суммарная длина АЗК, нм |
6595,2 ± 607,5 |
5660,0 ± 335,5 |
7140,2 ± 506,0 |
Таблица 4
Численная плотность синапсов с различной длиной активной зоны контакта в молекулярном слое коры сенсомоторной области мозга крыс линии К‒М после пороговых звуковых стимуляций и применения циклофосфана (ФВК-метод), M ± m
Длина АЗК, нм |
Группа животных |
||
Интактные (n = 16) |
15-кратные ЗС (n = 16) |
15-кратные ЗС и циклофосфан (n = 16) |
|
< 200 |
1,01 ± 0,02 |
1,31 ± 0,12* |
1,22 ± 0,08 |
201 ‒ 400 |
7,92 ± 0,52 |
2,95 ± 0,18* |
5,17 ± 0,33* |
401 ‒ 600 |
4,50 ± 0,23 |
1,95 ± 0,17* |
3,10 ± 0,20* |
601 ‒ 800 |
3,24 ± 0,39 |
4,11 ± 0,20* |
3,90 ± 0,29 |
> 800 |
1,02 ± 0,04 |
2,36 ± 0,11* |
1,85 ± 0,08* |
Таблица 5
Численная плотность асимметричных контактов с различной высотой плотных проекций в молекулярном слое сенсомоторной области мозга крыс линии К‒М после пороговых звуковых стимуляций и применения циклофосфана (ФВК-метод), M ± m
Группа животных |
Число синапсов с различий высотой ПП |
||
> 60 нм |
60‒51 нм |
50 нм и < |
|
Интактные (n = 16) |
7,26 ± 0,37 |
6,19 ± 0,29 |
4,24 ± 0,16 |
15-кратные ЗС (n = 16) |
6,85 ± 0,59 |
1,58 ± 0,11* |
2,13 ± 0,15* |
15-кратные ЗС и циклофосфан (n = 16) |
6,75 ± 0,51 |
3,11 ± 0,19* |
2,66 ± 0,16* |
Численная плотность функционирующих капилляров на площади 1 мм2 слоев I‒III коры сенсомоторной области несколько превышала контрольный уровень (табл. 2), менее выраженными были патоморфологические изменения стенки кровеносных сосудов.
Численная плотность синапсов в молекулярном слое коры сенсомоторной области меньше, чем у интактных животных (табл. 3). Увеличивалось содержание мелких, средних синапсов, и уменьшилось ‒ очень крупных. Содержание очень мелких и крупных контактов как у интактных животных (табл. 4). Количество синапсов со средними ПП было больше, чем без применения циклофосфана (табл. 5), в меньшей степени увеличивалась площадь СПШ, уменьшалось отношение СПШ/АЗК (табл. 6).
Таблица 6
Дендритные шипики молекулярного слоя коры сенсомоторной области мозга крыс линии Крушинского ‒ Молодкиной после пороговых звуковых стимуляций в тренирующем режиме и применения циклофосфана, M ± m
Показатель |
Группа животных |
||
Интактные (n = 16) |
15-кратные ЗС (n = 16) |
15-кратные ЗС и циклофосфан (n = 16) |
|
Площадь АЗК, нм2 |
109 111 + 926 |
155 918 + 1323* |
173 222 + 1470* |
Свободная от АЗК поверхность шипика (СПШ), нм2 |
278 233 + 2361 |
441 248 + 3744* |
294 478 + 2502* |
СПШ/АЗК |
2,55 |
2,83 |
1,70 |
Заключение
Таким образом, использование циклофосфана в иммунодепрессивных дозах при многократных пороговых звуковых стимуляциях с аудиогенными судорожными пароксизмами у половозрелых крыс линии К‒М сопровождается уменьшением выраженности патоморфологических изменений в коре сенсомоторной области. При этом численная плотность нейронов в слоях III‒IV сохраняется на контрольном уровне. По сравнению с животными без использования циклофосфана в 1,5 раза уменьшается количество гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней, в 2,2 раза ‒ гипер- и гипохромных нейронов, не происходит увеличения численной плотности глиальных клеток, увеличивается численная плотность и длина функционально активных капилляров в слоях I‒III, уменьшается редукция численной плотности синапсов в слое I, снижается гипертрофия дендритных шипиков.
-
S.I. Ereniev 1, V.V. Semchenko 2, S.S. Stepanov 1
-
1Omsk State Medical University, Omsk
-
2Omsk State Agrarian University named after P.A. Stolypin, Omsk
Structural and functional characteristics of cortex sensorimotor areas of the brain in rats after repeated audiogenic convulsive paroxysms and after use of immunosuppressive doses of Cyclophosphamidum
Список литературы Структурно-функциональная характеристика коры сенсомоторной области мозга крыс после многократных аудиогенных судорожных пароксизмов и применения иммуносупрессивных доз циклофосфана
- Ганнушкина И.В. Фиксация противомозговых сывороточных антител человека в различных отделах головного мозга кролика//Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1976. № 9. С. 1138-1141.
- Крушинский Л.В. Формирование поведения животных в норме и патологии. М.: Изд-во МГУ, 1960. 264 с.
- Машковский М.Д. Лекарственные средства; 16-е изд. М.: Новая Волна, 2012. 1216 с.
- Cazrullo C.L., Altamura A.C., Canger R., Petani L. Cobalt-induced experimental epilepsy in cats pharmacologically immunodepressed. An EEG and histological study//Arzneimittel-Forsch. 1976. V. 26, No 7. P. 1387-1393.
- Коган О.Г., Канчурин А.Х., Кузнецов О.В., Брусина Л.И. Роль торможения миграции глии у больных рассеянным склерозом и его динамика при лечении иммунодепрессантами//Журн. невропатол. и психиатр. 1981. Т. 81, вып. 12. С. 1798-1802.
- Mayhew T.M. Stereological approach to the study of synapse morphometry with particular regerg to estimating number in volum and a surface//J. Neurocytol. 1979. V. 8, No 2. P. 121-138.
- Семченко В.В., Степанов С.С., Боголепов Н.Н. Синаптическая пластичность головного мозга (фундаментальные и прикладные аспекты); 2-е изд. М., 2014. 408 с.
- Семченко В.В., Степанов С.С., Ерениев С.И. Структурно-функциональное восстановление нервной ткани головного мозга в постишемическом периоде с позиций представления о провизорности в репаративном гистогенезе//Тихоокеанский мед. журн. 2016. № 2. С. 98-102.
- Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002. 312 с.