Структурные и функциональные изменения печени в условиях повышенного поступления селена с кормами в организм животных

Одним из важнейших элементов, участвующих в процессах энергообмена, транспорта кислорода, предотвращения избыточного образования активных форм кислорода и обезвреживания их, является селен. Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) селен был отнесен к эссенциальным микроэлементам. В животном организме он является антиоксидантом, синергистом витамина Е, препятствует чрезмерной липоперокси-дации мембранных структур. Селен является антагонистом отдельных тяжелых металлов, поэтому способствует их выведению из организма [1]. В связи с этим проводятся мероприятия по обогащению продуктов питания растительного и животного происхождения этим микроэлементом [2]. В то же время вызывает тревогу возможность повышенного поступления данного элемента в организм животных в связи с селенизаци-ей продуктов питания на фоне отсутствия нормативных показателей содержания селена в объектах окружающей среды и по причине недостаточности сведений о механизме токсического действия этого элемента в животном организме. Особенно важным представляется изучение механизмов токсичного действия селена, поступившего с кормами в организм животных, выращенных на почвах, обогащенных этим элементом.

Цель исследования – дать эколого-токсикологическую оценку действия селена в системе «почва – растение – животное».

Объекты и методы

С целью нормирования содержания селена в системе «почва – растения – животное» проведен ряд исследований, позволяющих установить механизмы интоксикации селеном в условиях шестимесячного кормления животных растениями, выращенными с применением селена в расчетных дозах 0,5 и 1 ПДК [3].

Полевые опыты с кормовыми и зерновыми культурами проводились на опытном поле Омского ГАУ. Почвенный покров участка, на котором заложен полевой опыт, представлен лугово-черноземной маломощной тяжелосуглинистой почвой. Для основного внесения в почву использовали селен в виде селенита натрия, при этом дозы составляли 0,5–1 ПДК. Опыт заложен в четырехкратной повторности с систематической последовательностью размещения вариантов. По окончании уборки растениеводческую продукцию вводили в рацион животных согласно вариантам полевого опыта [3].

По окончании проведения эксперимента у животных контрольной и опытных групп («Se 0,5 ПДК» и «Se 1 ПДК») проводили забор органов. При проведении морфологических исследований в качестве материала использовали печень. Ткани органа фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине (рН = 7,2–7,4), проводили по спиртам и осуществляли заливку в парафин по общепринятой методике. Из парафиновых блоков изготавливали серийные срезы толщиной 4–5 мкм с использованием ротационного микротома Microm HM-340E (Carl Zeiss, Германия). Микропрепараты окрашивались по стандартной технологии гематоксилином и эозином с использованием рутинной методики [4].

При проведении биохимических исследований из ткани печени готовили надмитохондриальную фракцию, в которой определяли активность супероксиддисмутазы

[КФ 1.15.1.1] (СОД), каталазы [КФ 1.11.1.6], глутатионпероксидазы [КФ 1.11.1.9] (ГлПО), глутатионредуктазы [КФ 1.6.4.2] (ГлР), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [КФ 1.1.1.49] (Г-6-Ф ДГ), содержание глутатиона (G-SH) и малонового диальдегида (МДА). Исследовали также уровень гликогена, а в приготовленных липидных экстрактах – антиокислительную активность липидов, содержание диеновых конъюгатов (ДК) и липофусциноподобного пигмента (ЛФПП). Используемые в работе биохимические методы исследования описаны в статье [5]. Результаты исследования обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента и непараметрических методов математического анализа.

Результаты исследования

Селен, накапливаясь в продукции растениеводства, поступает по пищевой цепи в организм человека и животных, вызывая как положительные, так и негативные последствия [3; 6].

При повышенном поступлении в животный организм с растительной пищей большинство микроэлементов аккумулируются в печени, кроме того, этот орган играет основную роль в системе детоксикации организма.

Необходимым представлялось изучить морфофункциональное состояние печени у животных, потреблявших корма, выращенные с применением селена в расчетных дозах 0,5; 1 ПДК.

При макроскопическом исследовании печени животных установлено, что орган красно-бурого цвета, не увеличен в объеме.

При микроскопическом исследовании печени животных группы «Se 0,5 ПДК» отмечено лишь умеренное расширение центральных вен с полнокровием синусоидов.

В целом выраженных морфофункциональных изменений печени у животных, потреблявших корма, выращенные с применением селена в дозе 0,5 ПДК, не установлено.

При макроскопическом исследовании печени животных группы «Se 1 ПДК» установлено незначительное увеличение органа, капсула ее напряжена и имеет округлые края.

При микроскопическом исследовании в ткани печени наблюдали полнокровие центральных цен. В просвете центральных (вблизи центральной вены) отделов синусо-идов отмечали скопления эритроцитов, купферовских клеток. В отличие от животных группы «Se 0,5 ПДК», у животных группы «Se 1 ПДК» были обнаружены признаки слабой мононуклеарной воспалительной инфильтрации вдоль портальных трактов печени.

В паренхиме органа определяли белковую дистрофию гепатоцитов различной степени выраженности, причем преобладание данного вида дистрофии отмечалось в центролобулярных зонах. Известно, что активность внутриклеточных ферментов здесь выражена значительно больше, что обусловливает большую интенсивность метаболических нарушений [3; 6]. Мелкокапельную жировую дистрофию обнаруживали лишь изредка, в отдельных гепатоцитах.

Полученные данные свидетельствуют о наличии воспалительных и деструктивных процессов в местах первичного попадания селена в организм животного, в частности в паренхиму печени. Признаки нарушения белкового обмена демонстрируют токсическое воздействие повышенных количеств селена на белки, и прежде всего ферменты. Известно, что Se способен замещать S в молекулах белков, тем самым нарушая их структуру и функции [3; 7].

Таким образом, у крыс, которые потребляли корма, выращенные с применением селена в дозе 1 ПДК, отмечали признаки деструктивных и воспалительных процессов в печени, сопряженные с нарушением метаболической функции этого органа.

Следствием нарушения структуры печени являются биохимические изменения, что регистрировалось в исследованиях (табл. 1).

Таблица 1

Биохимические показатели плазмы крови контрольных крыс и крыс, получавших корма, обогащенные селеном, Х ± m, n = 10

Показатель	Группа животных
	Контроль	Se 0,5 ПДК	Se 1 ПДК
Общий белок, г/л	70,0 ± 3,27	69,2 ± 4,07	67,7 ± 3,01
Альбумины, г/л	46,9 ± 2,28	46,9 ± 3,29	39,3 ± 2,44
Глобулины, г/л	23,1 ± 2,85	22,3 ± 1,29	28,4 ± 1,9
Альбумины Глобулины	2,03 ± 0,20	2,10 ± 0,28	1,38 ± 0,20
Мочевина, моль/л	7,10 ± 0,73	7,43 ± 0,79	7,63 ± 0,36
Билирубин, моль/л	6,13 ± 0,09	6,26 ± 0,65	7,66 ± 0,26**
Мочевая кислота, мкмоль/л	179,8 ± 7,06	166,7 ± 8,16	226,8 ± 8,30**
Холестерин, моль/л	2,40 ± 0,22	2,12 ± 0,25	2,53 ± 0,36
Тимоловая проба, ед	0,72 ± 0,09	0,89 ± 0,08	0,9 ± 0,32*
АСТ, МЕ/л	56,3 ± 4,39	56,8 ± 3,39	61,9 ± 5,64*
АЛТ, МЕ/л	34,2 ± 1,84	36,7 ± 2,85	39,7 ± 1,62
Глюкоза, моль/л	4,17 ± 0,29	4,24 ± 0,37	5,42 ± 0,20*
Креатинин, мкмоль/л	45,1 ± 7,04	42,4 ± 3,94	50,0 ± 3,19

Примечание. *, **, *** – достоверность различий по сравнению с контролем (соответственно р < 0,05; р < 0,01; р < 0,001).

Согласно представленным данным у животных группы «Se 0,5 ПДК» не установлено изменения биохимических показателей, характеризующих функции печени, по сравнению с аналогичными значениями у крыс контрольной группы.

В плазме крови животных группы «Se 1 ПДК» наблюдается тенденция к снижению содержания общего белка и альбуминов. Наряду с этим в крови крыс данной группы отмечено увеличение тимоловой пробы на 25% (р < 0,05) по сравнению с контролем. Повышение коллоидно-осадочной пробы свидетельствует о нарушении соотношения между альбуминами и глобулинами крови, что связано с увеличением содержания глобулинов и уменьшением концентрации альбуминов. Тенденцию к нарушению экскреторной функции демонстрирует повышение уровня билирубина в крови животных группы «Se 1 ПДК» на 25,2% (р < 0,01) по сравнению с контролем.

На нарушение целостности гепатоцитов указывает повышение в плазме крови животных группы «Se 1 ПДК» активности ферментов по сравнению с контрольной группой крыс – АЛТ на 9,9% (р < 0,05), АСТ на 15,9% (р < 0,05). Таким образом, анализ биохимических показателей плазмы крови животных группы «Se 1 ПДК» свидетельствует о наличии структурных изменений мембран гепатоцитов и напряжении функции печени.

Одним из перспективных направлений работы по оценке степени реакции всей системы клеточного метаболизма у организмов под влиянием отдельных микроэлементов является изучение процессов перекисного окисления липидов. Они постоянно протекают в живой клетке при ее нормальной жизнедеятельности и являются «откликом» на окислительный стресс, возникающий при изменении условий окружающей среды. Поэтому резорбтивное действие повышенных количеств Se на клетки печени связано с нарушением энергетического обмена, нарастанием тканевой гипоксии, развитием ок-сидативного стресса вследствие токсического воздействия элемента на молекулы белков, ферментов и других органических соединений (табл. 2) [3; 6].

Таблица 2

Показатели перекисного окисления липидов в печени крыс при введении в их рацион кормов, обогащенных Se, Х ± m, n = 10

Показатель	Группа животных
	Контроль	Se 0,5 ПДК	Se 1 ПДК
Гликоген, мг/г белка	657 ± 34,2	715 ± 38,6*	481 ± 58,5***
Антиокислительная активность липидов, мэкв/мг липидов	10,2 ± 0,66	13,3 ± 1,06***	10,0 ± 1,03
Супероксиддисмутаза, ед./мг белка	19,5 ± 2,66	26,4 ± 4,48***	19,5 ± 2,85
Каталаза, ед./мг белка∙мин	12,4 ± 0,93	12,9 ± 0,72	11,6 ± 0,81
Диеновые конъюгаты, мэкв/мг липидов	0,34 ± 0,028	0,27 ± 0,09	0,445 ± 0,06***
Малоновый диальдегид, ед. оптич. плотн./мг белка	0,26 ± 0,04	0,19 ± 0,04**	0,35 ± 0,06**
Липофусциноподобный пигмент, ед. флуор./мг липидов	8,43 ± 0,59	8,05 ± 0,81	11,4 ± 1,97***
Глутатионпероксидаза, МЕ/мг белка	8,17 ± 0,91	13,3 ± 1,93**	4,92 ± 0,53***
Глутатион (G-SH), мкмоль/мг белка	466 ± 31,3	495 ± 36,7	436 ± 31,7
Глутатионредуктаза, мкмоль/(мг белка·мин)	252 ± 28,6	259,9 ± 18,0	232 ± 18,8
Глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа, мкмоль/мг белка·мин	14,4 ± 2,83	11,65 ± 2,18	11,25 ± 1,12

Примечание. *, **, *** – достоверность различий по сравнению с контролем (соответственно р < 0,05; р < 0,01; р < 0,001).

Согласно данным табл. 2, кормление животных растениями, выращенными при применении селена в дозе 0,5 ПДК, не только предотвращает увеличение уровня показателей перекисного окисления липидов (диеновых конъюгат, малонового диальдегида, липофусциноподобного пигмента) в печени, но и снижает эти показатели. Можно полагать, что введение селенсодержащих кормов приводит к стимуляции антиоксидантной системы даже при отсутствии усиления свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов. Об этом свидетельствует увеличение в печени антиокислительной активности липидов (30,1%, р < 0,001), активности супероксиддисмутазы на 35,2% (р < 0,001) по сравнению с контролем, а также активности глутатионпероксидазы на 62,7% (р < 0,001). Эффект селена по отношению к увеличению активности глутатионпероксидазы связан с тем, что в активном центре данного энзима содержится селен. Функционирование глутатионпероксидазы in vivo способствует тому, что введение кормов, содержащих селен в дозе 0,5 ПДК, сопровождается увеличением уровня глутатиона в печени на 8,65 (р < 0,05) по сравнению с контролем. Это может быть связано с усилением биосинтеза этого трипептида из аминокислот – его предшественников. Интенсивность восстановления в результате глутатионпероксидазной реакции глутатиондисульфида, по-видимому, не увеличивается. Отмечается тенденция к снижению активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени. Снижение этого показателя свидетельствует о том, что торможение активности фермента действительно имеет место.

Таким образом, введение в рацион животных кормов, выращенных на варианте с внесением селена в дозе 0,5 ПДК, не приводит к развитию в организме крыс признаков гипоксии, усилению перекисного окисления липидов, но способствует стимуляции антиоксидантной системы (повышение антиокислительной активности липидов, активности супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, содержания глутатиона) на фоне некоторого торможения активности ферментов, участвующих в восстановлении глутатиондисульфида.

Показатели, характеризующие состояние окислительных процессов в тканях животных при введении в рацион кормов, выращенных при основном внесении селена в дозе 1 ПДК, представлены в табл. 2. Установлено, что в печени отмечается напряженность окислительных процессов, о чем свидетельствует увеличение концентрации глюкозы в крови на 29,7% (р < 0,001). Гипергликемия развивается, по-видимому, за счет усиленного расщепления гликогена в печени, содержание которого у животных группы «Se 1 ПДК» снижено по сравнению с аналогичным параметром у контрольных крыс на 26,8% (р < 0,001). Можно полагать, что развившаяся гипергликемия связана с явлениями тканевой гипоксии, для компенсации которой ткани усиливают доставку глюкозы в клетку. На уровне организма это приводит к умеренной гипоксии, о чем свидетельствует увеличение концентрации молочной кислоты в крови крыс группы «Se 1 ПДК» (на 34,5% (р < 0,01) по сравнению с крысами контрольной группы).

Развившееся закисление тканей на фоне недостаточно эффективной генерации митохондриями АТФ приводит к усиленному катаболизму пуриновых мононуклеотидов до гипоксантина. Реутилизация последнего в адениловые нуклеотиды в результате реакции, катализируемой гипоксантинфосфорибозилтрансферазой, протекает малоэффективно вследствие неадекватной обеспеченности клеток рибозо-5-фосфатом. Это вещество генерируется в реакциях пентозного цикла из глюкозы. Несмотря на развившуюся гипергликемию, клетки обеспечены глюкозой в недостаточной степени вследствие усиленного окисления этого моносахарида в реакциях анаэробного гликолиза. Свидетельством его интенсификации является повышенная концентрация молочной кислоты в крови.

Сочетанное изменение этих процессов приводит к увеличению уровня гипоксантина с последующим усилением окисления до мочевой кислоты, концентрация последней в крови крыс группы «Se 1 ПДК» увеличена на 26,2% (р < 0,01).

Усиленное окисление гипоксантина до мочевой кислоты сопряжено с повышенной продукцией ксантиноксидазой активных кислородных метаболитов, которые приводят к торможению антиокислительной активности липидов и активности супероксид-дисмутазы, которая была повышена в тканях животных группы «Se 0,5 ПДК», до контрольного уровня. Следовательно, несмотря на активизацию селеном в оптимальных дозировках антиокислительной активности липидов и суперокиддисмутазы, наслаивается и тормозящий эффект высоких концентраций селена, снижая таким образом эффективность системы антиперекисной защиты.

Усиленная продукция активных кислородных метаболитов приводит к чрезмерной пероксидации мембранных структур, что выражается в увеличении концентрации диеновых коньюгат, малонового диальдегида, липофусциноподобного пигмента в печени (соответственно на 34,6; 33,6; 34,6% (р < 0,001) во всех случаях). Определенный вклад в усиление перекисного окисления липидов в тканях животных группы «Se 1 ПДК» вносит снижение эффективности системы антиперекисной защиты. Активность глутатионпероксидазы в печени снижена по сравнению с контролем на 39,8% (р < 0,001). По-видимому, этот фермент в недостаточной степени обеспечен глутатионом. Содержание данного трипептида в печени, несмотря на повышенную потребность в нем, не только не увеличивается, но и несколько снижается (на 6,28%, р > 0,05).

Определенный вклад в снижение уровня глутатиона вносит и недостаточно эффективное восстановление образующегося в глутатионпероксидазной реакции глутатион дисульфида. Активность глутатионредуктазы, катализирующей эту реакцию в печени, снижена на 7,83 (р > 0,05) по сравнении с контролем.

Закл ючение

Таким образом, введение в рацион животных кормов, выращенных на варианте с внесением селена в дозе 0,5 ПДК, не приводит к развитию в организме крыс признаков гипоксии, усилению перекисного окисления липидов и, как следствие, к структурным и функциональным изменениям печени. В то же время отмечается активизация антиоксидантной системы.

Введение крысам в рацион кормов, выращенных с применением селена в дозе 1 ПДК, приводит к напряжению окислительных процессов, что выражается в увеличении в крови содержания глюкозы на фоне снижения гликогена в печени. При этом в тканях выявлены признаки гипоксии, выражающиеся в увеличении концентрации молочной кислоты в крови. Развившееся вследствие этого закисление тканей усиливает катаболизм пуриновых мононуклеотидов, сопряженный с повышенной генерацией ксантиноксидазной активности кислородных метаболитов, ведущей к чрезмерной ли-попероксидации мембранных структур. Существенный вклад в этот процесс вносит недостаточно эффективное функционирование антиоксидантной системы, вызванное дисбалансом активности супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, а также неполноценное обеспечение тканей глутатионом.

У животных, потреблявших корма, выращенные с применением микроэлементов в дозе 1 ПДК, наблюдали слабо выраженные метаболические изменения, а также проявления гепатотоксического действия элементов. Результаты проведенных исследований следует учитывать при дифференциальной диагностике и профилактике хронических заболеваний печени токсического генеза.

A.V. Sindireva, I.N. Putalova, O.A. Zayko, V.D. Conway, E.Yu. Aleksandrovskaya

Structural and functional changes in the liver under the conditions of increased selenium dietary intake in animals