Судорожная готовность и структурно-функциональные изменения различных отделов головного мозга белых крыс в посттравматическом периоде

Изучение структурных механизмов повреждения и восстановления клетки, ткани, органа и организма в целом является необходимой составляющей регенеративной биологии и медицины. В разных органах существуют особенности реализации механизмов деструкции ткани и репаративного гистогенеза, которые требуют дальнейшего исследования [1]. Исход повреждения в нервной ткани (неполный дифферон) зависит от числа сохранившихся нейронов и их выхода из патологического состояния [1, 2]. Черепно-мозговая травма остается основной причиной необратимой неврологической инвалидизации пострадавших [2 - 4]. При ТСЧМТ существуют механизмы первичного и вторичного повреждения мозга [5, 6]. В зонах вторичного ишемического повреждения в посттравматическом периоде развиваются диффузно-очаговые нарушения перфузии мозга и гибели клеток [7]. При этом выявление «мозаики» структурнофункциональных изменений имеет большое значение для определения закономерностей посттравматического повреждения и восстановления головного мозга, в том числе при низком пороге активации поврежденных нейронов.

Целью настоящей работы являлось сравнительное изучение цитоархитектоники различных отделов головного мозга белых крыс, отличающихся порогом судорожной готовности мозга после ТСЧМТ.

Объекты и методы

Основу работы составили результаты острых и хронических экспериментов, выполненных на лабораторных белых крысах-самцах массой 200 - 240 г. Животные содержались в обычных условиях вивария, регламентируемых приказом МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983 г. Опыты проводили в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.77 и № 701 от 27.07.78 об обеспечении принципов гуманного обращения с экспериментальными животными.

В основе работы лежит исследование в параллельных группах, которое является наиболее объективным для выявления эффекта воздействия какого-либо независимого фактора и точным в формулировании выводов [8]. ТСЧМТ моделировалась у белых крыс по способу Нобла-Коллипа [9] под нембуталовым наркозом (внутрибрюшинно 30 мг/кг). Животные получали множественные ушибы, переломы, сопровождающиеся выраженной психоневрологической симптоматикой черепно-мозговой травмы. Летальность составила 55,2 %. У части выживших крыс в течение первого часа развивались генерализованные тонико-клонические судороги. Выжившие животные разделены на две группы. В группу I входили животные (группа сравнения, n = 25) без судорожного синдрома, в группу II - животные (основная группа, n = 25) с различными клиническими проявлениями снижения порога СГМ: спонтанное двигательное возбуждение, судорожные пароксизмы. Контролем служили животные (n = 20) без ТСЧМТ.

Для изучения ориентировочно-исследовательского поведения и эмоционально-психических реакций крыс после ТСЧМТ использовали тест «открытое поле» [10]. Регистрировали следующие показатели: латентный период, горизонтальную и вертикальную двигательную активность, обнюхивание отверстий, груминг, количество дефекаций.

Забор материала для морфологического исследования осуществляли через 1, 3, 7, 14, 30 сут после травмы (по 4 - 5 животных на срок). Эвтаназию осуществляли под эфирным наркозом путем обескровливания. Головной мозг животных фиксировали в смеси 4 %-ного раствора параформальдегида, 1 %-ного раствора глютарового альдегида, 5 %-ного раствора сахарозы на 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7,4), заключали в парафин, готовили фронтальные серийные срезы толщиной 4 - 5 и 7 - 10 мкм, окрашивали гематоксилином-эозином и по Нисслю. На цифровых изображениях серийных фронтальных срезов головного мозга (по 5 полей зрения на отдел) изучали цито- и миелоархитектонику коры головного мозга, гиппокампа, таламуса, миндалевидного комплекса и гипоталамуса. Определяли площадь изучаемых отделов головного мозга, площадь серого и белого вещества, тел нейронов, общую численную плотность нейронов (ОЧПН) на 1 мм², абсолютное и относительное (%) содержание нормохромных, гиперхромных несморщенных, пикноморфных, гипохромных нейронов и клеток-теней, содержание глиальных клеток, ядерно-цитоплазматическое и нейро-глиальное отношение. Морфометрическое исследование проводили с помощью программы ImageJ 1.46. Проверку статистических гипотез проводили с помощью программы Statistica 8.0. Для проверки статистических гипотез применяли методы ранговой статистики (ANOVA Фридмана, Краскела-Уоллиса, критерий Вилкоксона, Манна-Уитни, корреляционный анализ Спирмена, логистическую регрессию). Нулевая гипотеза отвергалась, а альтернативная принималась при уровне значимости p < 0,05, что вполне достаточно для медико-биологических исследований [11].

Результаты исследований

Через сутки после моделировании ТСЧМТ крысы обеих групп были заторможены, малоподвижны, горизонтальная и вертикальная двигательная активность были резко снижены, длительность латентного периода увеличена. Интенсивность и продолжительность эмоциональной составляющей поведения - груминга превышала контрольные значения (табл. 1).

Таблица 1

Ориентировочно-исследовательская деятельность крыс групп 1 и 2-й в посттравматическом периоде (М ± m)

Показатель	Контроль	Время после травмы (сутки)
		1                           1	7 1	14             1	30
Группа I
Горизонтальная активность	57,2 ± 1,3	39,8 ± 1,7*	52,3 ± 2,6	53,3 ± 1,8	54,3 ± 2,5
Вертикальная активность	11,5 ± 0,6	5,3 ± 0,2*	10,9 ± 1,3	9,9 ± 0,9	8,9 ± 1,1
Норки	4,9 ± 0,4	5,1 ± 0,6	4,8 ± 0,3	3,6 ± 0,7	4,2 ± 0,1
Груминг	6,5 ± 1,1	19,8 ± 2,1*	20,6 ± 3,0*	11,9 ± 0,4*	16,9 ± 1,0*
Дефекации	1,5 ± 0,07	1,0 ± 0,05*	2,0 ± 0,01*	2,4 ± 0,06*	2,2 ± 0,02*
Латентный период	13,7 ± 0,8	25,9 ± 1,3*	14,1 ± 0,9	11,9 ± 1,2	12,9 ± 1,1
Группа II
Горизонтальная активность	27,3 ± 1,4	13,8 ± 1,0*^	16,1 ± 1,1*^	17,7 ± 0,6*^	11,0 ± 0,7*^
Вертикальная активность	7,3 ± 0,4	4,0 ± 0,5*	3,5 ± 0,2*^	5,0 ± 0,3*	3,1 ± 0,2*^
Норки	2,3 ± 0,1	3,6 ± 0,1*	2,3 ± 0,1	2,4 ± 0,3	2,1 ± 0,1^
Груминг	7,8 ± 0,4	13,3 ± 0,9*	29,2 ± 2,1*	7,3 ± 0,8^	29,3 ± 0,9*^
Дефекации	2,4 ± 0,07	0,9 ± 0,06*	2,2 ± 0,03	1,7 ± 0,09*	1,4 ± 0,1*^
Латентный период	16,2 ± 0,9	39,1 ± 3,4*^	26,7 ± 2,2*^	17,8 ± 1,3	26,9 ± 1,9*^

*Различия в сравнении с контролем были статистически значимы при р < 0,05; ^ различия между группами статистически значимы при р < 0,05 (t - критерий Стьюдента для независимых выборок).

Через 7-14 сут после травмы происходило частичное восстановление показателей, характеризующих поведение животных. Ориентировочно-исследовательские показатели у крыс I группы нормализовались, у крыс II группы горизонтальная и вертикальная активность оставалась низкой, продолжительность латентного периода была выше, чем в контроле. При этом в обеих группах сохранялся высокий уровень эмоциональной напряженности – продолжительность и интенсивность груминга возросли, увеличилось число дефекаций. Через 1 месяц после перенесенной травмы между группами сохранялись значимые различия по всем изученным показателям (см. табл. 1). Все это свидетельствовало о существовании особенностей восстановле- ния ориентировочно-исследовательского поведения и эмоционально-психических реакций животных групп I и II, отличающихся уровнем СГМ после ТСЧМТ. Процессы восстановления функций высших отделов мозга более интенсивно протекали у крыс группы I.

Анатомические морфометрические показатели (площадь серого и белого вещества, площадь изученных отделов мозга на серийных срезах) по центральным тенденциям статистически значимо не различались. Различия касались только индивидуальной пространственной локализации очагов ушибов и кровоизлияний головного мозга. При этом анатомические последствия травмы были типичными для ТСЧМТ – мелкие, средние и крупные очаги геморрагического повреждения мозговой ткани.

Гистологическое исследование показало, что после ТСЧМТ развивались типичные очаговые и диффузно-очаговые ишемические повреждения головного мозга. В первые 3 сут преобладали острые гиперхромные дегидратационные, хроматолитические, отечные изменения нейронов и набухание астроглии. В более отдаленном периоде (7, 14 сут) увеличивалось содержание пикноморфных и гипертрофированных нормохромных нейронов.

По данным морфометрического исследования, между изученными отделами головного мозга (внутри групп) и сроками посттравматического периода (1, 3, 7, 14 и 30 сут), а также между группами (по срокам) с различным порогом СГМ имелись статистически значимые различия по всем изученным гистологическим показателям (табл. 2). При этом у животных с низким порогом СГМ было статистически значимо выше содержание реактивно измененных нейронов (1, 3 и 7 сут) и дефицит ОЧПН (особенно через 14 и 30 сут).

По данным корреляционного анализа Спирмена и логистической регрессии, низкий порог СГМ после травмы ассоциировался с высоким содержанием реактивно измененных нейронов (r = 0,65; p < 0,05), дефицитом ОЧПН (r = 0,57; p < 0,05) и увеличением численной плотности глиальных клеток (r = 0,45; p < 0,05).

Таблица 2

Результаты сравнительного изучения цитоархитектоники головного мозга белых крыс групп I и II в посттравматическом периоде

Отделы головного мозга	Проверка статистических гипотез
	По срокам внутри группы I (ANOVA Фридмана)	По срокам внутри группы II (ANOVA Фридмана)	Между группами (критерий Манна-Уитни)
Кора головного мозга
ОЧПН	+	+	+ (7, 14, 30 сут)
содержание НН	+	+	+ (1, 3, 7, 14, 30 сут)
содержание РИН	+	+	+ (1, 3, 7, 14, 30 сут)
содержание ГК	+	+	+ (7, 14)
НГО	+	+	+ (7, 14)
ЯЦО	+	+	+ (3, 7, 14 сут)
Гиппокамп
ОЧПН	+	+	+ (3, 7, 14, 30 сут)
содержание НН	+	+	+ (3, 7, 14, 30 сут)
содержание РИН	+	+	+ (1, 3, 7, 14, 30 сут)
содержание ГК	+	+	+ (7, 14)
НГО	+	+	+ (7, 14)
ЯЦО	+	+	+ (3, 7, 14 сут)
Таламус
ОЧПН	+	+	+ (7, 14, 30 сут)
содержание НН	+	+	+ (3, 7 сут)
содержание РИН	+	+	+ (3, 7 сут)
содержание ГК	+	+	-
НГО	+	+	-
ЯЦО	+	+	-

Окончание табл. 2

Отделы головного мозга	Проверка статистических гипотез
	По срокам внутри группы I (ANOVA Фридмана)	По срокам внутри группы II (ANOVA Фридмана)	Между группами (критерий Манна-Уитни)
Миндалевидный комплекс
ОЧПН	-	+	+ (7, 14, 30 сут)
содержание НН	+	+	+ (3, 7 сут)
содержание РИН	+	+	+ (3, 7 сут)
содержание ГК	+	+	-
НГО	+	+	-
ЯЦО	+	+	-
Гипоталамус
ОЧПН	-	+	-
содержание НН	+	+	+ (1 сут)
содержание РИН	+	+	+ (1 сут)
содержание ГК	+	+	-
НГО	+	+	-
ЯЦО	+	+	-

Примечание : «+» – подтверждение альтернативной гипотезы при р < 0,05; ГК – глиальные клетки; ОЧПН – общая численная плотность нейронов; НГО – нейро-глиальное отношение, НН – нормохромные нейроны; РИН – реактивно измененные нейроны; ЯЦО – ядерно-цитоплазматическое отношение в нормохромных нейронах.

Выводы

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об особенностях реакции на ТСЧМТ нейронов различных отделов головного мозга в зависимости от уровня порога СГМ в посттравматическом периоде. Установлено, что процессы структурно-функционального восстановления высших отделов мозга более интенсивно протекают у крыс с нормальным порогом СГМ. У крыс с низким порогом СГМ выявлен более выраженный дефицит нейронов. Вероятно, активация нейронов, вовлеченных в реализацию судорожных пароксизмов у животных с низким порогом СГМ, сопровождается усиленной гибелью нервных клеток. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости использования в посттравматическом периоде различных методов нейропротекции.