Свидетельствует ли повышенная частота гетерозигот по генам групп крови свиней о гетерозисе по жизнеспособности?

Феномен гетерозиса и неоднозначность множества теоретических истолкований этого явления постоянно привлекают к себе внимание генетиков и селекционеров, которые небезосновательно считают одной из классических причин гибридной мощности гетерозиготность. Во многих работах при исследовании популяций и гибридов животных различных видов были использованы генетические маркеры, позволяющие оценивать степень гетерозиготности (1-4). При этом в популяциях свиней выявлено статистически значимое превышение частоты гетерозигот по генам, детерминирующим группы крови, над теоретически ожидаемыми по закону Харди-Вайнберга. Традиционно это объясняли повышенной жизнеспособностью (гетерозисом по жизнеспособности или общей приспособленности), свойственной гетерозиготам (5-7).

Следует, однако, отметить, что оценка жизнеспособности генотипов различных классов по избытку гетерозигот в популяции, несмотря на кажущуюся простоту метода, не является корректной (8). Кроме того, применительно к рассматриваемому классу генов иммуногенетических маркеров (аллелей систем групп крови) подобная трактовка феномена гетерозиса, на первый взгляд самая простая и логичная, таковой не является, потому что существует еще более простое объяснение, которое основывается на погрешностях метода выявления маркеров (антигенов) в иммунологических реакциях антиген—антитело с помощью специфических антисывороток-реагентов. По нашему мнению, только детально проанализировав это возможное обстоятельство и опровергнув его, можно далее рассматривать какие-либо другие гипотезы, например о селективном преимуществе гетерозигот по генам групп крови как свидетельстве гетерозиса по жизнеспособности. Однако подобные рассуждения едва ли корректны, если гипотезу не удастся опровергнуть с надлежащей достоверностью.

Выдвигаемая нами гипотеза заключается в том, что если антисыворотка-реагент, которую считают моноспецифической (наличие антител только к одному конкретному антигену), содержит так называемые «паразитические» антитела (поэтому не является моноспецифической), то будет наблюдаться «имитация» повышения числа гетерозиготных особей. Вероятность такой ситуации может быть во многих случаях вполне реальной, так как обусловлена спецификой технологии приготовления реагентов. Как правило, антисыворотки, полученные в результате иммунизации, исходно оказываются поливалентными, в связи с чем их многоступенчато очищают, удаляя посредством абсорбции «лишние» антитела. Очищенные реагенты идентифицируют в сравнительных испытаниях, проверяя моноспецифичность на выборках животных («панелях») с уже известными фено- и генотипами (1). Однако из-за ограниченности таких выборок (обычно 30-50 особей) всегда остается вероятность того, что в проанализированном реагенте все еще содержатся «паразитические» антитела, в том числе родственных подклассов, различающиеся по интенсивности иммунологических реакций. Следует также учитывать, что каждый класс и подкласс иммуноглобулинов имеет свои особые биологические свойства, о которых все еще мало известно. Поэтому нередко после более строгого сравнения (например на меж- дународных испытаниях) оказывалось, что некоторые из реагентов, прежде считавшихся моноспецифичными, требуют дополнительной очистки. В этом аспекте проблемы главное, что позволяет свести до минимума возможность загрязнения специфических иммунных сывороток, — использование в качестве анализирующей «пане- ли» максимально возможного числа животных, контрастных по спектру антигенов.

Следовательно, полученные и идентифицированные антисыворотки-реагенты даже после сравнительных испытаний могут считаться моновалентными лишь условно, что и требует дальнейшего иммунологического анализа. Поэтому «избыточное» число положительно реагирующих с такой антисывороткой особей в популяции (а среди них больше всего гетерозиготных) на самом деле может сигнализировать всего лишь о «засоренности» реагента (ди- или поливалентность) и не иметь отношения ни к гетерозису, ни к жизнеспособности. В связи с этим при обнаружении в выборке повышенного числа гетерозигот по какой-либо из систем групп крови возникает необходимость объективной проверки реагента (или реагентов) на их моно- или поливалентность.

Поскольку моноспецифичность реагента не всегда удается выявить серологическими методами, одним из способов его оценки может служить статистический анализ сегрегации фенотипов потомков в скрещиваниях по генам систем групп крови, что и было целью нашей работы.

Методика. Объектом исследования служили гибридные свиньи, полученные при скрещивании хряков, происходящих из светлогорской популяции мини-свиней, со свиноматками крупной белой породы (экспериментальное хозяйство СО РАН, Новосибирск). Все поголовье было аттестовано по 42 эритроцитарным антигенам 11 систем групп крови с использованием антисывороток-реагентов, полученных в Институте цитологии и генетики СО РАН (табл. 1).

Моноспецифичность реагентов была неоднократно подтверждена в сравни-

1. Антигены различных систем групп крови гибридных свиней (крупная белая х миниатюрная светлогорская), тестированные различными им- муногенетическими реагентами

Система групп крови Число реагентов Антигены А 2 Аа, АO В 1 Ва D 2 Da, Db Е 10 Еа, Eb, Ed, Ее, Ef, Eg, Ei, Ej, Ek, El F 3 Fa, Fb, Fd G 2 Ga, Gb Н 2 Ha, Hb J 1 Ja К 7 Ka, Kb, Kc, Kd, Ke, Kg, Kf L 10 La, Lb, Lc, Ld, Lf, Lg, Li, Lj, Lk, Ll М 2 Ma, Me крови от ожидаемой (менделевской) (1, 9).

тельных испытаниях, проводившихся под эгидой Международного общества генетики животных (ISAG). Эти реаген- ты в течение ряда лет также применяли для массового ти-пирования многих тысяч свиней и диких кабанов, в том числе и семей породы ландрас и ландрас-кабаньих гибридов. При этом реагенты зарекомендовали себя как высокоспецифические; не было выявлено существенных отклонений фактической сегрегации потомков по генотипам систем групп

Однако у гибридов в комбинации скрещивания крупная белая х х миниа- тюрная светлогорская на основе использования стандартных статистических методов (10) было обнаружено достоверное превышение фактического числа гетерозигот над ожидаемым. Для проверки гипотезы о дивалентности реагента нами была проанализирована сегрегация аллелей у 519 потомков в 57 семьях по семи типам скрещиваний.

Результаты. Для некоторых аллелей систем D, F, G, J, К, L групп крови ги- потеза о моногенном менделевском наследовании отвергалась с вероятностью от 0,950 до 0,999. При этом наблюдались два противоположных явления: недостаток и избыток особей в классах, позитивных по анализируемому аллелю. Так, отмечен недостаток потомков, позитивных по аллелям Da и Кас (соответственно системы D и K). Ранее было установлено, что это вызвано сцеплением локусов систем D и K с летальными факторами, наиболее интересным свойством которых является «вертикальный 39

кумулятивный» эффект (11). Последний, возможно, вызван генетическим импринтингом, при котором негативное влияние фактора у гетерозиготных потомков усиливается в результате его взаимодействия с генотипом гетерозиготной матери, то есть имеет место явление, противоположное эффекту иммунологической несовместимости. Вследствие этого относительная жизнеспособность гетерозиготных потомков, полученных от матерей, гомозиготных и гетерозиготных по нормальному аллелю, составляла соответственно 1 и ~ 0,5.

По системам F, G, J и L групп крови, напротив, наблюдалось статистически достоверное увеличение числа гетерозиготных потомков. Поэтому соотношения генотипических классов по генам этих систем в экспериментальных семьях были проверены на соответствие гипотезе о дивалентности реагента.

Для оценки адекватности этой гипотезы была разработана модель, которая отражает расхождение по частоте реальных и «имитируемых» дивалентным реагентом фенотипов (табл. 2). Согласно модели, использование при иммуногенетическом анализе (по системе, условно обозначенной А 1 ) не абсолютно моноспецифического реагента (содержащего кроме антител к основному антигену, условно обозначенному А 1^а , еще и «паразитические» антитела к антигену А 2^х ) должно вызвать попадание в «основной» А 1^а -позитивный фенотипический класс А 1^а -негативных фенотипов, позитивных по антигену А 2^х . Следовательно, частота А 1^а -позитивных особей оказывается завышенной на величину, определяемую частотой антигена А 2^х .

2. Оценка соответствия реальных фенотипов по модельному антигену A₁ ^a фенотипам, выявляемым дивалентным реагентом, содержащим «паразитические» антитела к антигену А₂ ^х системы А₂ (не сцепленной с системой А₁) групп крови гибридных свиней (крупная белая х миниатюрная светлогорская)

Фактический фенотип		Реагент
Антиген А 1	Антиген А 2 х	анти-А 1 а	анти-A 1 а + анти-А 2 х
А 1а (+)	А 2х (+)	А 1а (+)	А 1а (+)
А 1а (+)	А 2х (–)	А 1а (+)	А 1а (+)
А 1а (–)	А 2х (+)	А 1а (–)	А 1а (+)
А 1а (–)	А 2х (–)	А 1а (–)	А 1а (–)

П р и м е ч а н и е. A 1^a (+), A 2^х (+) и A 1^a (–), A 2^х (–) — фенотипы, соответственно позитивные (+) и негативные (–) по антигенам A 1^a и А 2^х .

В случае, когда в системе А₁ выявляются два аллеля ( А₁^а и А₁^b ), при использовании реагента анти-А 1^a , содержащего «паразитические» антитела к антигену А 2^x , генотип A 1^b /A 1^b A 2^x /∙ будет ошибочно принят за A 1^a /A 1^b . Это в свою очередь повлечет за собой идентификацию части особей, гомозиготных по аллелю А₁^b , как гетерозиготных A₁ ^a /А₁ ^b , а в целом частота гетерозигот в исследуемой выборке окажется завышенной по сравнению с теоретически ожидаемой. Данные подобного анализа могут ошибочно интерпретироваться как свидетельство повышенной жизнеспособности (гетерозиса) таких «псевдогетерозиготных» особей.

Гипотеза о дивалентности антисывороток была проверена на основе соотношений генотипических классов (по системам групп крови) при скрещивании хряков, гетерозиготных по аллелям, дающим избыточное число «гетерозиготных» потомков, с «негативными» гомозиготными свиноматками (табл. 3). Обнаруженные отклонения для иммуногенетических систем F, G, J и L групп крови согласуются с предлагаемой моделью. Значения х 2 , превышающие стандартный уровень, позволяют с достоверностью отвергнуть гипотезу о моноспецифичности реагентов, используемых для выявления антигенов Gb, Ja, Lb. Альтернативные гипотезы также свидетельствуют о дивалентности этих антисывороток.

3. Сравнительная оценка сегрегации аллелей по системам групп крови гибридных свиней (крупная белая х миниатюрная светлогорская) на соответствие гипотезам о моно- и дивалентности антисыворотки-реагента

Тестируемый антиген	Локус	Комбинация скрещивания ( 9 х d )	Число семей	Число потомков			х 2
				«позитивные»	«негативные»	всего	H 1	Н 2

Fb	EAF	F a /F a х F a /F b	10	50	24	74	9,14	2,18
Ga	EAG	G b /G b х G a /G b	8	37	44	81	0,60	37,14
Gb	EAG	G a /G a х G a /G b	2	16	5	21	5,76	0,02

Ja	EAJ	J o /J o х J a /J o	7	66	25	91	18,47	0,30
Lb	EAL	L a /L a х L a /L b	15	85	41	126	15,37	3,82
В том числе хряки:
¹ 1		L a /L a х L a /L b	9	64	18	82	25,80	0,41
¹ 2		L a /L a х L a /L b	6	21	23	44	0,09	13,45

П р и м е ч а н и е. H и Н — критерий % ² , рассчитанный соответственно для моно- (1:1) и дивалентной (3:1) сыворотки.

Некоторые сложности с принятием гипотезы о дивалентности реагентов возникли только для аллеля L^a из-за относительно высокого значения х : из двух хряков только один (¹ 1) оказался гетерозиготным одновременно и по аллелю L^a и по фактору, выявляемому «паразитическим» антителом (см. табл. 3). Второй хряк (¹ 2) не обладал генотипом, полностью пригодным для анализа, что и повлияло на общую картину сегрегации объединенного потомства двух пробандов. Расщепление в потомстве хряка ¹ 1 очень четко отражает корректность гипотезы о дивалентности антисыворотки.

Следовательно, результаты проведенного анализа статистически значимо показывают, что избыток позитивных (якобы «гетерозиготных») фенотипов на самом деле вызван «засоренностью» реагентов неидентифицированными «паразитическими» антителами к антигенам Fa, Gb, Ja и La. Эти антитела, вероятно, являются нетипичными и редкими для анализируемых популяций свиней, а повышенная «гетерозиготность» гибридов крупная белая х миниатюрная светлогорская обусловлена не автоматически приписываемым гетерозиготам гетерозисом по жизнеспособности, а методическими погрешностями.

Не исключено, что выявлению дивалентности антисывороток, прежде считавшихся моноспецифическими, способствовало использование гибридов филогенетически отдаленных пород свиней. Возможно (хотя это достаточно спорно и требует дальнейшего исследования), что у гибридов увеличивалась концентрация отдельных антигенов, обычно невысокая и визуально не улавливаемая, что и позволило обнаружить последние, а также отметить эффект гетерозиса. Именно поэтому присутствие дополнительных «паразитических» антител не удавалось выявить ранее, несмотря на значительные объемы типированных этими реагентами в течение ряда лет выборок свиней породы ландрас и ландрас-кабаньих гибридов.

Итак, полученные нами данные можно рассматривать как доказательство того, что даже регулярная многолетняя сравнительная оценка реагентов на международных испытаниях и при семейном анализе не дает 100 % гарантии моноспецифичности антисывороток. В связи с этим к результатам иммуногенетических исследований, которые свидетельствуют о заметном преобладании в популяциях гетерозигот по системам групп крови, необходимо относиться критически, что особенно касается «молодых» популяций гибридного происхождения. Прежде чем рассматривать гипотезу о повышенной жизнеспособности гетерозигот по генам иммуногенетических маркеров, следует все-таки проводить адекватный статистический анализ результатов скрещиваний, которые позволяют выявлять случаи «имитации» гетерозиса, обусловленные дивалентностью реагентов, считавшихся до того моновалентными.

Л И Т Е Р А Т У РА

• 1.   Т и х о н о в В.Н. Использование групп крови при селекции животных. М., 1967.

• 2.   Э й д р и г е в и ч Е.В., Р а е в с к а я В.В. Интерьер сельскохозяйственных животных. М., 1978.

• 3.    М а ш у р о в A.M. Генетические маркеры в селекции животных. М., 1980.

• 4.    Т и х о н о в В.Н. Иммуногенетика и биохимический полиморфизм домашних и диких свиней. Новосибирск, 1991.

• 5.   А л т у х о в Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М., 1983.

• 6.   К и р п и ч н и к о в B.C. Генетика и селекция рыб. Л., 1987.

• 7.   H a l d a n e J.B.S. On the biochemistry of heterosis and stabilization of polymorphism. Proc. Royal. Soc.

• 8.   Л е в о н т и н Р. Генетические основы эволюции. М., 1978.

• 9.   Т и х о н о в В.Н., Т р о ш и н а А.А., Г о р е л о в И.Г. и др. Создание ландрас-кабаньих гибридов

  для промышленных свинокомплексов. Новосибирск, 1981.

• 10.    Л а к и н Г.Ф. Биометрия. М., 1990.

• 11.    G o r e l o v I.G., O r l o v a G.V., N i k i t i n S.V. e.a. Deviation from Mendelian segregation of blood group loci D and К in crosses of Large White and Miniature pig breeds. Proc. of 6th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. Armidale, Australia, 1998: 632-635.

London, 1955, В 144: 143-221.

Новосибирский государственный аграрный                    Поступила в редакцию 15

университет , 630039, Новосибирск, ул. Добролюбова, 160,                     января 2003 года

Институт цитологии и генетики СО РАН , Новосибирск

DOES THE INCREASED FREQUENCY OF HETEROZYGOTES ON GENES OF PIGS BLOOD GROUPS SUGGEST ABOUT HETEROSIS ON VIABILITY?

S.P. Knyazev, S.V. Nikitin, I.G. Gorelov, I.V. Danil’chenko

S u m m a r y

The authors presented the results of statistical analysis of the phenotypes segregation in progeny of cross-bred pigs (Large White x Miniature Svetlogorskaya) on alleles of different systems of blood groups. With the purpose of estimation of monospecificity of immunogenetic reagents to erythrocytes antigens the incidents of increased frequency of heterozygotes on alleles of systems of F, G, J and L blood groups were analyzed. The model was proposed, which reflects the discrepancy between real phenotypes and « simulated» by divalency reagent. It was shown, that heterosis observed with divalency serum evaluating by raise of concentration of single antigens and leads to excess of heterozygotes of corresponding alleles. The authors propose to carry out the adequate statistical analysis of cross-bred results before to draw a conclusion about increased viability of heterozygotes on genes of immunogenetic markers.