Таксономический состав микробиоты рубца коров при заболеваниях копытец

Последующие звенья развития болезни связывают с разрушением грамотрицательных бактерий при низком pH и выходом липополисахарида клеточной стенки в рубцовую жидкость. Одновременно с этим происходит накопление гистамина и других биогенных аминов. Повреждение эпителиального барьера рубца обеспечивает проникновение этих соединений в кровоток, где они вызывают воспалительную реакцию [6]. Опытным путем показано, что изменение состава рубцовой микробиоты сопровождается развитием ламинита, а у коров с поражением копытец содержание липополисахарида и молочной кислоты в сыворотке крови достоверно выше, чем у клинически здоровых животных [7].

Отдельного рассмотрения заслуживает роль фузобактерий. Fusobacterium necropho-rum использует молочную кислоту как источник энергии, вследствие чего его численность в содержимом рубца при ацидозе возрастает. Проникновение возбудителя через поврежденную слизистую оболочку обусловливает развитие абсцессов печени и гнойнонекротических поражений конечностей [8]. В отечественной работе, выполненной на северных оленях с клиническими признаками нек-робактериоза, у больных животных установлено достоверно более высокое содержание фу-зобактерий, а также бактерий рода Staphylococcus. У здоровых особей, напротив, преобладали расщепляющие клетчатку представители класса Clostridia и бактерии класса Nega-tivicutes, сбраживающие кислоты [9]. Это подтверждает связь между состоянием микробио- ты рубца и развитием поражений конечностей у жвачных.

Применение ампликонного секвенирования гена 16S рРНК позволило существенно расширить представления о составе рубцового сообщества по сравнению с посевом на питательные среды [10]. Метод основан на наработке участка гена, присутствующего у всех бактерий, с последующим прочтением полученных копий и сопоставлением их со справочной базой. Он дает надежное разделение таксонов до уровня семейства, но не позволяет уверенно различать виды внутри рода.

Вместе с тем работ, в которых состав микробиоты рубца сопоставлялся бы непосредственно с наличием заболеваний копытец у коров, крайне мало, а выполненных на отечественном поголовье практически нет. Большинство доступных сведений получено при опытном воспроизведении ацидоза рационом, тогда как состояние сообщества бактерий при естественно возникшем заболевании может отличаться от такового при кратковременном закислении рубцовой среды [11].

Цель исследований - выявить таксономические группы микробиоты рубцовой жидкости, относительная численность которых различается у коров с заболеваниями копытец и здоровых животных, и сопоставить полученную картину с признаками, свойственными субклиническому ацидозу рубца.

Условия, материалы и методы. Исследование выполнено в 2025 г. на базе СХПК «ПЗ им. Ленина» (Республика Татарстан). По результатам осмотра сформировали две группы по пять животных: опытную - с выраженными заболеваниями копытец, контрольную - без признаков поражения конечностей. Все подопытные лактирующие коровы находились в одинаковых условиях круглогодичной однотипной системы содержания и сбалансированного кормления, отвечающего современным требованиям.

У исследуемых особей была отобрана рубцовая жидкость методом зондирования. Пробоподготовку образцов осуществляли в отделе физиологии, биохимии, генетики и питания животных ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН. Геномное исследование рубцовой жидкости проводилось на базе научно-исследовательской лаборатории «Молекулярная генетика микроорганизмов» на кафедре генетики ИФМиБ КФУ.

Достоверность межгрупповых различий определяли U-критерием Манна–Уитни, различия считали достоверными при p< 0,05.

Результаты и обсуждение. Данные геномного анализа свидетельствуют о близких значениях видового богатства в сравниваемых группах. Число обнаруженных таксономических единиц составило 862 у больных животных и 938 у здоровых. При выраженном закислении содержимого рубца часть микроорганизмов гибнет, сообщество беднеет, и разнообразие закономерно снижается. Сообщество микроорганизмов у больных животных осталось таким же богатым как у здоровых. Перестройка затронула не микробный состав как таковой, а соотношение между отдельными группами.

Наиболее выраженное достоверное различие установлено для типа Bacteroidota , преобладавшего у больных животных (p = 0,008) (табл. 1). Доля Firmicutes при этом в группах практически совпадала, то есть перестройка произошла не за счет вытеснения одного преобладающего типа другим, а за счет расширения количества Bacteroidota при неизменной доле Firmicutes . Значение этого сдвига определяется строением клеточной стенки. Bacteroidota составляют основную часть грамотрицательных бактерий рубца и рост их доли означает увеличение запаса липополисахарида, высвобождаемого при разрушении клеток.

Таблица 1 – Относительная численность таксонов на уровне типа, %

Таксон	Здоровые (n = 5)	Больные (n = 5)	Статистическая значимость
Bacteroidota	48,20 ± 5,00	60,50 ± 4,52	p<0,05
Firmicutes	30,50 ± 6,07	32,40 ± 6,58	нет
Proteobacteria	16,30 ± 11,00	1,85 ± 1,09	нет
Actinobacteriota	0,615 ± 0,828	1,530 ± 1,400	нет
Patescibacteria	1,080 ± 0,265	0,864 ± 0,452	нет
Spirochaetota	1,400 ± 0,861	0,603 ± 0,618	нет
Fibrobacterota	0,330 ± 0,210	0,168 ± 0,246	нет
Campilobacterota	0,197 ± 0,301	0,011 ± 0,010	p<0,05
Fusobacteriota	0,00	0,081 ± 0,068	p<0,05

Различие по Proteobacteria не достигло принятого уровня значимости, хотя средние значения различаются почти в девять раз. Причина в том, что в контрольной группе доля этого типа колебалась от 1,5 до 31,0%, и столь большой разброс по пяти животным не позволяет признать разницу достоверной.

Отдельного внимания заслуживают фузо-бактерии. Представители типа Fusobacteriota обнаружены у четырех больных животных из пяти и не выявлены ни у одного здорового (p<0,05). Таким образом, группы различаются не количеством этих бактерий, а самим фактом их присутствия или отсутствия. Доля бактерий Campilobacterota, напротив, у больных снижается (p<0,05).

Направление изменений по фузобактериям совпадает с данными отечественных исследований, в которых у северных оленей с некробак-териозом установлено достоверно более высокое их содержание [9]. По кампилобактериям картина неоднозначна. У оленей их численность при болезни возрастала. Расхождение может объясняться как видом животных, так и применявшимся в цитируемой работе методом Т-RFLP, который дает иное разделение таксонов, чем секвенирование.

Значения по бактериям Bacteroidia, Campyl-obacteria и Fusobacteriia полностью повторяют показатели соответствующих типов. Такое совпадение означает, что внутри этих типов представлен всего один класс и говорит о неслучайном характере различий. Они воспроизводятся на нескольких уровнях иерархии, а не возникают на одном из них.

Дополнительные сведения дают три класса типа Firmicutes (табл. 2). Доля класса Clostridia, объединяющего основных разрушителей клетчатки, в группах существенно не различалась. Это первый признак того, что ожидаемой при ацидозе картины здесь нет, угнетение расщепляющих клетчатку микроорганизмов считается одним из наиболее устойчивых ее проявлений, а в данном биоматериале они отсутствуют.

Таблица 2 – Относительная численность таксонов на уровне класса, %

Таксон	Здоровые (n = 5)	Больные (n = 5)	Статистическая значимость
Bacteroidia	48,20 ± 5,00	60,50 ± 4,52	p<0,05
Clostridia	21,20 ± 3,30	24,00 ± 6,59	нет
Negativicutes	7,10 ± 1,94	5,03 ± 2,72	нет
Bacilli	2,24 ± 1,710	3,23 ± 0,446	нет
Gammaproteobacteria	16,30 ± 11,00	1,78 ± 1,18	нет
Actinobacteria	0,557 ± 0,797	1,300 ± 1,510	нет
Saccharimonadia	0,870 ± 0,174	0,750 ± 0,338	нет
Spirochaetia	1,400 ± 0,861	0,567 ± 0,563	нет
Fibrobacteria	0,330 ± 0,210	0,168 ± 0,246	нет
Campylobacteria	0,197 ± 0,301	0,011 ± 0,010	p<0,05
Fusobacteriia	0,0	0,081 ± 0,068	p<0,05

Класс Negativicutes объединяет основных потребителей молочной и янтарной кислот, то есть ту часть сообщества бактерий, которые непосредственно противодействует закислению. У больных животных он представлен меньше, однако различие статистически незначимо. Направление изменения совпадает с данными по северным оленям, у которых сбраживающие кислоты бактерий этого класса преобладали у здоровых особей [9]. У класса Bacilli, включающего как образующие молочную кислоту Lactobacillales, так и Erysipelotrichales, наблюдалась тенденция к увеличению, за этой общей склонностью, как показано ниже, стоят разнонаправленные изменения входящих в него порядков.

Достоверное преобладание у больных животных установлено для бактерий Erysipelotri-chales (p<0,05) (табл. 3). Этот результат является наиболее значимым в рамках данного исследования. Он совпадает с итогами изучения рубцового сообщества бактерий коров с ламинитом, где среди преобладавших таксонов у больных животных установлен род Erysipelotricha-ceae UCG-009 [7]. Сходное изменение отмечено и при опытном воспроизведении ацидоза у мелкого рогатого скота [12]. Таким образом, речь идет о единственном таксоне, для которого имеются подтверждения сразу из двух независимых источников.

Таблица 3 – Относительная численность таксонов на уровне порядка, %

Таксон	Здоровые (n = 5)	Больные (n = 5)	Статистическая значимость
1	2	3	4
Bacteroidales	48,20 ± 5,00	60,50 ± 4,52	p<0,05
Lachnospirales	11,40 ± 2,53	12,10 ± 8,48	нет
Oscillospirales	5,77 ± 4,17	6,94 ± 4,64	нет
Clostridia UCG-014	2,72 ± 0,763	3,16 ± 1,74	нет
Acidaminococcales	4,03 ± 2,51	2,69 ± 2,45	нет
Veillonellales-Selenomonadales	3,07 ± 1,19	2,32 ± 1,17	нет

Продолжение таблицы 3

1	2	3	4
Erysipelotrichales	0,720 ± 0,124	1,770 ± 0,642	p<0,05
Aeromonadales	16,00 ± 11,10	1,12 ± 1,00	нет
Lactobacillales	0,980 ± 1,530	1,02 ± 0,601	нет
Spirochaetales	1,400 ± 0,861	0,567 ± 0,563	нет
RF39	0,344 ± 0,078	0,140 ± 0,106	p<0,05
Staphylococcales	0,018 ± 0,026	0,078 ± 0,031	p<0,05
Campylobacterales	0,197 ± 0,301	0,011 ± 0,010	p<0,05
Fusobacteriales	0,0	0,081 ± 0,068	p<0,05

Достоверное увеличение установлено также для порядка Staphylococcales (p<0,05). Этот итог повторяет данные отечественной работы, в которой у северных оленей с некробактерио-зом отмечено более выраженное присутствие бактерий рода Staphylococcus , часть видов которого способна вызывать гнойнонекротические поражения [9]. Доля таксона мала, вследствие чего результат следует считать предварительным.

Порядки Lachnospirales и Oscillospirales , объединяющие основные бактерии расщепления клетчатки, в группах существенно не различались [13]. Это подтверждает наблюдение, что звено сообщества бактерий, которое обеспечивает переваривание грубых кормов и через жевательную активность поддерживает естественную буферную защиту рубца, у больных животных не изменилось. Снижение доли порядка RF39 (p<0,05) истолковать затруднительно, поскольку сведений о его значении для рубца жвачных не имеется.

Увеличение доли Bacteroidales обеспечивается, главным образом, семейством Prevotel-laceae (p<0,05) – наиболее многочисленным в обеих группах (табл. 4). Его представители расщепляют крахмал, пектин и белковые вещества корма, то есть те составляющие рациона, содержание которых возрастает при увеличении количества концентрированных кормов. Само по себе преобладание этого семейства не свидетельствует о болезни. Здесь речь идет о постоянных обитателях рубца, а не о возбудителях. Значение имеет то, что Prevotellaceae составляют основную часть грамотрицатель-ной микрофлоры рубца и при разрушении клеток в кислой среде служат главным источником липополисахарида [6]. Иными словами, у больных животных увеличена не численность возбудителей, а количество микроорганизмов, служащих источником липополисахарида при разрушении их клеток в условиях закисления содержимого рубца и повреждения эпителиального барьера.

Таблица 4 – Относительная численность таксонов на уровне семейства, %

Таксон	Здоровые (n = 5)	Больные (n = 5)	Статистическая значимость
Prevotellaceae	38,00 ± 2,37	47,20 ± 4,21	p<0,05
Lachnospiraceae	11,40 ± 2,55	12,00 ± 8,32	нет
Rikenellaceae	1,94 ± 0,72	4,71 ± 3,86	нет
Ruminococcaceae	3,37 ± 2,04	3,21 ± 1,45	нет
Acidaminococcaceae	4,03 ± 2,51	2,68 ± 2,46	нет
Erysipelatoclostridiaceae	0,586 ± 0,171	1,450 ± 0,672	p<0,05
Selenomonadaceae	1,240 ± 0,691	1,270 ± 0,543	нет
Succinivibrionaceae	15,90 ± 11,00	1,12 ± 1,00	нет
[Eubacterium] coprostanoligenes group	0,370 ± 0,119	1,070 ± 0,568	p<0,05
Veillonellaceae	1,83 ± 1,69	1,05 ± 1,37	нет
Streptococcaceae	0,289 ± 0,216	0,867 ± 0,630	нет
Erysipelotrichaceae	0,134 ± 0,105	0,320 ± 0,151	p<0,05
Fibrobacteraceae	0,330 ± 0,210	0,168 ± 0,246	p<0,05
Lactobacillaceae	0,683 ± 1,440	0,145 ± 0,135	нет
RF39	0,344 ± 0,078	0,140 ± 0,106	p<0,05
Gemellaceae	0,018 ± 0,026	0,078 ± 0,031	p<0,05
Fusobacteriaceae	0,0	0,071 ± 0,052	нет
Campylobacteraceae	0,034 ± 0,016	0,011 ± 0,010	p<0,05

Достоверные различия установлены для обоих семейств порядка Erysipelotrichales - Erysipel-atoclostridiaceae (p<0,05) и Erysipelotrichaceae (p<0,05), что подтверждает воспроизводимость полученного результата. Сдвиг прослеживается и на уровне порядка, и на уровне обоих входящих в него семейств. Семейство [Eubacterium] coprostanoligenes group также достоверно преобладало у больных животных (p<0,05). Значение этой группы бактерий для рубца жвачных изучено недостаточно, поэтому объяснить это различие с точки зрения обмена веществ пока невозможно. Отметим лишь то, что изменения совпадают с данными, полученными при воспроизведении ацидоза [12].

Наибольшая по величине разница между группами приходится на семейство Succinivibri-onaceae . У больных животных его доля снижена примерно в четырнадцать раз, однако из-за очень большого разброса значений в контрольной группе различие не достигает принятого уровня значимости. Представители этого семейства образуют янтарную кислоту, являющуюся предшественником пропионовой, и потребляют водород, конкурируя за него с образующими метан археями. Снижение их доли указывает на перестройку путей брожения в рубце. Схожие изменения установлены у коров с ламинитом, где доли родовых групп Succinivibri-onaceae UCG-002 и Succinivibrionaceae UCG-001 снижались более чем в пять раз [7]. Совпадение направления и величины при разном поголовье и разных условиях содержания делает этот итог заслуживающим внимания, несмотря на отсутствие формальной достоверности.

Полученные данные по типу Fusobacteriota отнесены к семейству Fusobacteriaceae и роду Fusobacterium . Принадлежность к виду по данным секвенирования гена 16S рРНК надежно не устанавливается, вследствие чего отнесение выявленных представителей к F. necrophorum требует подтверждения видоспецифичной полимеразной цепной реакцией. Тем не менее обнаружение фузобактерий исключительно у животных с поражением копытец согласуется с данными, полученными при некробактериозе северных оленей [9].

Не менее важно то, какие признаки в полученном материале отсутствуют. Развитие ацидоза рубца описывается устойчивой последовательностью событий: избыток крахмала вызывает размножение бактерий, образующих молочную кислоту Streptococcaceae и Lactobacil-laceae; накопление молочной кислоты превышает возможности ее потребителей, прежде всего Veillonellaceae; закисление угнетает расщепляющие клетчатку Fibrobacteraceae и Rumi-nococcaceae; сообщество бактерий «беднеет», и видовое разнообразие снижается [4]. Ни одно из звеньев этой последовательности в исследованном материале достоверно не выражено. Различия по Streptococcaceae и Veillonellaceae недостоверны, по Lactobacillaceae разнонаправленны и сопровождаются очень большим разбросом значений; расщепляющие клетчатку семейства сохранены, видовое разнообразие не снижено.

Таким образом, у коров с заболеваниями копытец состав микробиоты рубца действительно отличается от такового у здоровых животных, однако выявленные отличия не характерны для развернутого субклинического ацидоза. Наблюдаемое состояние правильнее охарактеризовать как умеренное нарушение соотношения групп микроорганизмов при сохранном составе сообщества бактерий в целом. При этом четыре из семи таксонов, допускающих прямое сопоставление с опубликованными данными по коровам с ламинитом, изменяются в том же направлении [7]. Совпадение получено при разном поголовье, разных условиях содержания и разных способах подбора групп, что повышает его значимость.

Состав рубцового сообщества у обследованных животных ближе к данным, описанным при поражении копытец, нежели ацидоза. Это не означает, что связь между ацидозом и заболеваниями копытец отсутствует. Более вероятно, что однократный отбор проб пришелся на период, когда закисление содержимого рубца уже миновало, а перестройка сообщества, сопутствующая поражению копытец, сохранялась [14]. Впервые получены сведения о таксономическом составе микробиоты рубца при заболеваниях копытец и показано непосредственное совпадение с зарубежными данными по ламиниту и с отечественными данными по некробак-териозу северных оленей.

Выводы. У коров с заболеваниями копытец установлено достоверное увеличение относительной численности бактерий Bacteroidota , Prevotellaceae , порядка Erysipelotrichales с обоими входящими в него семействами, [Eubacterium] coprostanoligenes group и Staphy-lococcales , а также снижение долей Campylobac-terales и RF39 . Представители рода Fusobacte-rium выявлены у четырех больных животных из пяти и не обнаружены ни у одного здорового; их видовая принадлежность требует подтверждения полимеразной цепной реакцией.

Признаки развернутого субклинического ацидоза рубца в исследованном материале достоверно не выражены. Дальнейшего изучения на расширенном поголовье требуют изменения численности бактерий Erysipelotrichales и Staph-ylococcales , а также видовая принадлежность выявленных фузобактерий. Ограничения работы определяются объемом выборки. При объемах групп по пять животных наименьшее достижимое значение p составляет 0,008, поправка на множественность сравнений не вводилась, вследствие чего полученные результаты имеют низкую достоверность и требуют проверки на большем поголовье.