Технология генотипирования сои на основе SSR-локусов ДНК
Автор: Рамазанова С.А., Гучетль С.З., Челюстникова Т.А., Антонова Т.С.
Статья в выпуске: 2 (141), 2009 года.
Бесплатный доступ
Проведена идентификация 73 генотипов сои с использованием тринадцати полиморфных микросателлитных локусов. Для каждого локуса вычислен индекс полиморфного информационного содержания (PIC), составивший от 0,18 до 0,81, и эффективное число аллелей, которое варьировало от 1,44 до 4,5. Для всех генотипов сои получены уникальные наборы аллелей. Для каждого сорта разработана молекулярно-генетическая формула, которую предложено использовать как соответствующий паспорт для идентификации и сертификации
Соя, ssr-локусов днк, аллели, генотипирование удк
Короткий адрес: https://sciup.org/142150915
IDR: 142150915
Текст научной статьи Технология генотипирования сои на основе SSR-локусов ДНК
Введение. В настоящее время одним из главных методологических подходов в изучении генетического полиморфизма растений является применение молекулярных маркеров. С их использованием можно различать генотипы растений, т.е. получить индивидуальную характеристику отдельного генотипа – ДНК-профиль. Метод анализа полиморфизма микросателлитных локусов позволяет получить воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома и поэтому является наиболее перспективным для идентификации, паспортизации и сертификации сортов и гибридов культурных растений [1, 2].
По данным ряда авторов, высокий уровень полиморфизма у сои, достаточный для паспортизации, удалось выявить только по микросателлитным локусам [3-6].
Поэтому целью наших исследований является разработка удобной в использовании, относительно быстрой и надежной технологии для генотипирования сои на основе анализа полиморфизма микросателлитных локусов ДНК.
Материалы и методы. В работе было использовано 73 генотипа, в том числе 67 сортов сои из разных стран, три образца полукультурной сои ( G. gracilis ) и три образца дикорастущей сои ( G. soya ).
Выделение ДНК, ее амплификацию, электрофорез и визуализацию продуктов амплификации проводили по стандартным методикам в авторской модификации, описанными нами ранее [7].
Индекс полиморфного информационного содержания (PIC) [8] и эффективное число аллелей [6] вычисляли по формулам:
Pict = 1 - ^=1Pji2 (1), где P – частота j паттерна для локуса i и суммирование распространяется на n паттернов.
ne = 1/27=1 P;"i2 (2), где ne – эффективное число аллелей.
Идентификацию и определение размеров аллелей микросателлитных локусов проводили с использованием программы Gel-Pro Analyzer 3.1.
Статистическую обработку результатов и построение дендрограммы проводили с помощью кластерного анализа методом Уорда.
Результаты и обсуждение. В основе предлагаемой технологии генотипирования сои лежит метод анализа полиморфизма микросателлитных локусов, выявляемый посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием пар праймеров комплементарных последовательностям, фланкирующим микросателлитные повторы. При выборе праймеров важным критерием являлось выявляемое ими количество аллелей микросателлитного локуса. Поэтому на основании литературных данных [3, 4, 9] были выбраны 16 пар праймеров к микросателлитным локусам и проанализирована коллекция генотипов, включающая сорта селекции ВНИИМК и других российских и зарубежных селекцентров, а также дикорастущих генотипов, полиплоидных и реплоидных форм.
Результаты амплификации ДНК 73 генотипов сои показали, что из 16 изученных SSR-локусов 13 проявили себя как полиаллельные, воспроизводимые и информативные. Мономорфными в изученной коллекции генотипов оказались локусы Soyac71 и 138ct04, а локус Sat43 был плохо воспроизводимым. Поэтому анализ выполняли по 13 SSR-локусам, представленным в таблице 1.
Таблица 1 – Характеристика микросателлитных локусов ДНК
|
Локус |
оследовательность фланкирующих раймеров 5’-3’ |
Повтор |
Молекулярный вес продукта (п.н) |
Количество аллелей |
Эффективное число аллелей |
PIC* |
|
Satt1 |
AGT ACA TAG ATA TTA AAG TCT AAA TGA TGA ACG TGA ATT ATT |
(ATT) 24 |
141-150 |
4 |
3,32 |
0,70 |
|
Satt 2 |
AAT AAT GTG GAA ACT AAA TGG TAA TGT GCC TAT CCT TGT CTT |
(AAT) 18 |
140-152 |
2 |
1,72 |
0,42 |
|
Satt5 |
TAT CCT AGA GAA GAA CTA AAA AA GTC GAT TAG GCT TGA AAT A |
(TAA) 21 |
157-177 |
4 |
3,43 |
0,71 |
|
Satt9 |
ATT ACT AGA GAA ATT AGT TTA CTT ACT AGG GTA TTA ACC CTT |
(AAT) 12 |
142-221 |
5 |
5,30 |
0,81 |
|
Soypr 1 |
CGA AGA GCT ACG TGC CAA ATT GTT AGA AAA CTC CGC CCA CAC |
(TAT) 20 |
163-188 |
2 |
1,87 |
0,46 |
|
Soygy 2 |
AAA ATT GAA AGT GTC ACA CCC C TTA AAA TCG ATT AAT TGG CAT GA |
(AT) 9 (ATT) 6 |
167-175 |
3 |
1,22 |
0,18 |
|
Sat 1 |
CTG GTG GAC TAT TGA TAC GAC C AAC TGC GAA GAT ACT ACC CTC C |
(AT) 17 |
188-235 |
4 |
3,56 |
0,72 |
|
Sat 36 |
AAA TTC TGT TCA TTG TCC GTC CAT TTT AAT ATC CCG AGT AGG |
(AT) 19 |
115-185 |
2 |
1,45 |
0,31 |
|
Soyhsp176 |
TGT GGG CCA CAA AAC GTA TAG CGT ACG TTC TAG CTA GTC TTC |
(AT) 15 |
118-135 |
3 |
1,62 |
0,38 |
|
Soybab |
TAG AAT GAC AGG ACA TCA CAT TCA TCA TTT TGT AGG CCA ACT |
(АТ) 24 |
289-342 |
3 |
1,53 |
0,35 |
|
Soyhsp179 |
ATA CCA GTT GAT CTG CAT ATT AAA ACA TCG TCT ACT TAA GTC |
(ТА) 10 |
178-228 |
2 |
1,59 |
0,37 |
|
Soysc514 |
AGT CGT AGT CTA GCT ACA TGA C CAG TGG AAT ATG TGA AGC AAT G |
(АТ) 14 |
171-209 |
3 |
2,09 |
0,52 |
|
138ct21 |
TGA GGC ACA TTG TTC TGG CGG GTA CCC ATG AAT TGG |
(CT) 20 |
85-102 |
2 |
1,28 |
0,21 |
|
Среднее |
- |
- |
3 |
2,31 |
0,47 |
* PIC – индекс полиморфного информационного содержания
В изученной группе генотипов по 13 микросателлитным локусам было выявлено всего 39 аллелей. Число аллелей на локус варьировало от 1 до 5, что в среднем составило 3 на локус. У локуса Satt9 было выявлено максимальное количество аллелей – пять, у трех локусов Satt1, Satt5 и Sat1 – по четыре, у пяти локусов Soygy2, Sat36, Soyhsp176, Soybab, Soysc514 – по три, у локусов Satt2, Soypr1, Sat36, 138ct21 и Soyhsp179 – по 2 аллеля.
Эффективное число аллелей – показатель, характеризующий локусы по частоте встречаемости аллелей, – в изучаемой выборке генотипов варьировало от 1,22 до 5,3. Среднее эффективное число аллелей на локус составило 2,34 (табл. 1).
Для анализа данных амплификации микросателлитной ДНК использовали индекс полиморфного информационного содержания (PIC). Он был рассчитан по формуле (1) для каждого SSR-локуса и варьировал от 0,21 для локуса 138ct21 до 0,81 для локуса Satt9 (табл. 1). Среднее значение индекса полиморфного информационного содержания для изученной группы генотипов составило 0,47.
На довольно малое для маркерной системы число PIC повлияло то, что два локуса показали очень низкие значения – 0,18 (Soygy2) и 0,21 (138ct21). У этих локусов частоты встречаемости аллелей сильно различались, так как некоторые из них были обнаружены только у дикорастущих и полукультурных генотипов и совсем не выявлены у сортов сои. Например, у локуса Soygy2 аллель 1 выявлен только у полукультурных ( G. gracilis) , а аллель 3 у дикорастущих ( G. soja ) генотипов (табл. 2).
Таблица 2 – Формулы генотипов сои
|
Сорт |
Формула |
Сорт |
Формула |
|
Лань (ВНИИМК) |
А 2 B 2 C 2 D 1 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 1 K 1 L 2 M 2 |
Sari (Иран) |
A 2 B 1 C 2 D 4 E 2 F 2 G 1 H 3 I 2 J 3 K 2 L 1 M 2 |
|
Лира (-//-) |
A 1 B 1 C 1 D 3 E 2 F 1 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Sepideh (-//-) |
A 2 B 1 C 3 D 5 E 1 F 1 G 1 H 3 I 2 J 2 K 1 L 2 M 2 |
|
Фора (-//-) |
A 2 B 1 C 2 D 2 E 1 F 4 G 1 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Sahar (Иран) |
A 3 B 1 C 1 D 1 E 2 F 2 G 1 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
Валента (-//-) |
A 3 B 2 C 2 D 4 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Safi-Abad1 (-//-) |
A 3 B 2 C 2 D 5 E 2 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
Дельта (-//-) |
A 3 B 2 C 2 D 5 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 1 M 2 |
Shimаbara wase (Япония) |
A 1 B 2 C 1 D 1 E 1 F 1 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 3 M 2 |
|
Парма (-//-) |
A 3 B 1 C 1 D 4 E 2 F 2 G 2 H 2 I 2 J 1 K 2 L 3 M 2 |
Юг-30 (Украина) |
A 3 B 2 C 2 D 5 E 2 F 3 G 2 H 3 I 2 J 2 K 1 L 2 M 2 |
|
Рента (-//-) |
A 3 B 2 C 2 D 2 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 1 K 2 L 3 M 2 |
Офелия (-//-) |
A 2 B 1 C 1 D 1 E 2 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
РВБ (-//-) |
A 3 B 2 C 2 D 3 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 1 K 2 L 1 M 2 |
Припять (Белоруссия) |
A 2 B 2 C 2 D 5 E 1 F 2 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
РВФ (-//-) |
A 2 B 2 C 2 D 2 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Брянская Мия (-//-) |
A 3 B 2 C 2 D 1 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 1 K 1 L 2 M 2 |
|
Веста (-//-) |
A 2 B 1 C 3 D 3 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 3 M 2 |
Красивая Меча (РФ, Орел) |
A 2 B 1 C 3 D 3 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 3 M 2 |
|
Вилана (-//-) |
A 3 A 4 B 2 C 2 D 1 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Ланцетная (-//-) |
A 2 B 2 C 1 D 2 E 2 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 1 L 3 M 2 |
|
Лакта (-//-) |
A 2 B 2 C 2 D 2 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Алтом (РФ, Алтай) |
A 1 B 2 C 3 D 5 E 1 F 4 G 2 H 3 I 2 J 3 K 2 L 2 M 2 |
|
Ника (-//-) |
A 2 B 2 C 2 D 1 E 2 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Сибниисхоз 6 (РФ, Омск) |
A 1 B 2 C 3 D 3 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
Дива (-//-) |
A 2 B 2 C 1 D 5 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Эльдорадо (-//-) |
A 2 B 2 C 2 D 3 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
Диана (-//-) |
A 2 B 1 C 2 D 2 E 3 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 3 M 2 |
Приморская 56 (РФ, Благовещенск) |
A 1 B 1 C 4 D 3 D 5 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 1 L 3 M 2 |
|
Памела (-//-) |
A 3 B 1 C 2 D 3 E 1 F 4 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Касатка (РФ, Рязань) |
A 3 B 2 C 3 D 3 E 1 F 3 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 3 M 2 |
|
Д-6 (-//-) |
A 1 B 2 C 1 D 3 E 2 F 1 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Светлая (-//-) |
A 3 B 2 C 2 D 1 E 1 F 2 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 1 M 2 |
|
Д-4 (-//-) |
A 1 B 2 C 1 D 3 E 2 F 2 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Малета (-//-) |
A 3 B 2 C 2 D 4 E 2 F 3 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
Альба (-//-) |
A 2 B 2 C 2 D 3 E 2 F 4 G 2 H 3 I 2 J 1 K 2 L 2 M 2 |
Магева (-//-) |
A 3 B 2 C 4 D 3 E 1 F 3 G 1 H 3 I 2 J 2 K 1 L 1 M 2 |
|
Трембита (-//-) |
A 3 B 2 C 4 D 3 E 2 F 3 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 3 M 2 |
Белгородская 6 (РФ, Белгород) |
A 1 B 2 C 2 D 5 E 2 F 2 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
Лиана (-//-) |
A 3 B 2 C 4 D 2 E 2 F 2 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Белгородская 48 (-//-) |
A 4 B 2 C 4 D 2 E 2 F 3 G 2 H 3 I 2 J 3 K 1 L 2 M 2 |
|
Лада (-//-) |
A 3 B 2 C 3 C 2 D 4 E 2 F 2 G 2 H 2 I 2 J 1 K 2 L 3 M 2 |
Селекта301(РФ, Краснодар) |
A 4 B 2 C 2 D 1 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 1 K 2 L 2 M 2 |
|
Б-2 (-//-) |
A 2 B 2 C 3 D 1 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 3 M 2 |
К-10641 (ВИР) |
A 3 B 2 C 1 D 4 E 2 F 3 G 2 H 3 I 1 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
Дуар (ВНИИМК, Армавир) |
A 4 B 2 C 3 D 1 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 1 M 2 |
Кубанская 4958 (КОС ВИР) |
A 4 B 2 C 3 D 5 E 1 F 4 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 1 M 2 |
|
Williams (США) |
A 2 B 2 C 4 D 5 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 1 K 2 L 2 M 2 |
Куба (-//-) |
A 2 B 2 C 3 D 1 E 2 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
Hood-75 (-//-) |
A 2 B 2 C 2 D 1 E 2 F 1 G 1 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
K-4947 ( G.gracilis ) |
A 2 A 4 B 1 C 2 D 1 E 2 G 2 F 2 H 1 I 1 J 2 K 1 K 2 L 3 M 1 |
|
Т-215 (-//-) |
A 4 B 1 C 2 D 4 E 2 F 4 G 1 H 3 I 1 J 3 K 1 L 3 M 2 |
K-5683 ( G.gracilis ) |
A 2 B 1 C 3 D 4 E 2 F 4 G 2 H 3 I 1 J 2 K 1 K 2 L 2 M 1 |
|
Т-201 (-//-) |
A 1 B 1 C 4 D 1 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
K-5142 ( G.gracilis ) |
A 2 B 2 C 2 D 5 E 2 F 4 G 1 H 1 I 2 J 2 K 1 L 3 M 1 |
|
Т-245(-//-) |
A 2 B 1 C 3 D 2 E 1 F 3 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 3 M 1 |
К-1007( G.soya ) |
A 4 B 1 C 1 D 3 E 1 F 4 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 1 |
|
Stine 52 (-//-) |
A 2 B 1 C 4 D 5 E 2 F 2 G 1 H 3 I 2 J 2 K 1 L 2 M 2 |
Соя-93 ( G.soya ) |
A 4 B 2 C 1 D 2 E 2 F 3 G 2 H 2 I 3 J 2 K 1 L 2 M 1 |
|
Stine 01 (-//-) |
A 2 B 2 C 4 D 5 E 2 F 1 G 1 H 3 I 2 J 2 K 1 L 2 M 2 |
Соя-133 ( G.soya ) |
A 4 B 2 C 1 D 2 E 2 F 3 G 2 H 2 I 3 J 1 K 2 L 2 M 1 |
|
Алдана (Польша) |
A 3 B 2 C 1 D 4 E 2 F 3 G 2 H 3 I 2 J 2 K 1 L 2 M 2 |
Е-шен-доу (Китай) |
A 4 B 1 C 2 D 4 E 2 F 4 G 2 H 3 I 1 J 3 K 1 L 3 M 1 |
|
Goldor (Франция) |
A 1 B 2 C 3 D 5 E 1 F 1 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 3 M 2 |
RP-Вилана |
A 2 B 2 C 2 D 1 E 2 F 1 G 2 H 3 I 2 J 1 K 2 L 2 M 2 |
|
Yieso (-//-) |
A 2 B 2 C 1 D 5 E 2 F 3 G 1 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Вилана (тетраплоид) |
A 1 B 2 C 4 D 5 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
|
Petit Jaune de Hongrie (-//-) |
A 3 B 2 C 4 D 1 E 1 F 3 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
Williams (тетраплоид) |
A 3 B 2 C 3 D 3 E 1 F 2 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 1 M 2 |
|
Bomax (Канада) |
A 2 B 2 C 3 D 5 E 1 F 1 G 2 H 2 I 2 J 2 K 2 L 2 M 2 |
СП-1422-1461 |
A 2 B 2 C 4 D 5 D 4 E 1 F 4 G 2 H 3 I 2 J 2 K 2 L 3 M 2 |
|
Orinoqua (Бразилия) |
A 3 B 2 C 2 D 4 E 2 F 1 G 1 H 3 I 2 J 2 K 2 L 2 M 1 |
* Примечание: код локуса A-Satt1; B-Satt2; C-Satt5; D-Satt9; E-Soypr1; F- Sat1; G-Sat36; H-Soyhsp176, I-Soygy2, J-Soybab, K-Soyhsp179, L-Soysc514,M-138ct21.
На начальном этапе исследования были выбраны 9 пар микросателлитных праймеров, описанных в работах зарубежных авторов [3, 4]. Был оценен их уровень полиморфизма в коллекции, содержащей 61 генотип сои, включающей 52 сорта сои ( G. max ) разных стран, три образца полу-культурной сои ( G. gracilis) , три – дикорастущей сои ( G. soja ) и 3 – полиплоидных и реплоидных форм сои.
Результаты амплификации ДНК 61 генотипа сои, описанные нами ранее [7], показали, что девяти изученных SSR-локусов было недостаточно для идентификации всех образцов. Для сорта Ника селекции ВНИИМК и реплоидной формы, полученной из сорта Вилана, а также дикорастущих генотипов Соя-93 и Соя-133 по девяти SSR-локусам были получены идентичные наборы аллелей. Увеличение количества анализируемых локусов с 9 до 13 позволило отличить сорт Ника от реплоидной формы (форма с возвратной кратно пониженной плоидностью), полученной из сорта Вилана, по локусу Soybab, а по локусам Soyhsp179 и Soybab различить дикорастущие генотипы Соя-93 и Соя-133 (табл. 2)
В результате исследований для каждого сорта на основании полученного набора аллелей микросателлитных локусов были составлены молекулярно-генетические паспорта, или так называемые «генетические формулы генотипов», представленные в таблице 2. Большими буквами латинского алфавита был обозначен код локуса, а нижний индекс – аллельное состояние данного локуса.
Риcунок – Дендрограмма генетических взаимоотношений между 73 генотипами сои, построенная по данным анализа 13 SSR-локусов.
На основании полученных данных о частоте встречаемости аллелей и об их размере была проведена оценка степени генетического родства изученных генотипов сои. Для этой цели был прменен кластерный анализ с использованием дисперсионного анализа оценки расстояний между кластерами (метод Уорда). Полученная дендрограмма представлена на рисунке. Анализ полученного иерархического дендрита позволил выделить в выборке исследованных генотипов сои два основных кластера.
Кластер I можно разделить еще на два крупных субкластера. В один из них наряду с сортами вошли образцы дикорастущей и полукультурной сои Соя-133, Соя-93, К-1007 ( G. soya ) и К-4947, К-5683, К-5142 ( G. gracilis ), а также стародавний китайский сорт Е-шен-доу.
Дендрограмма характеризует генетические расстояния между сортами сои, что представляет интерес для селекционеров при выборе пар скрещиваний для создания новых сортов.
Выводы. В результате проведенной работы было установлено, что дискриминационный потенциал изученной маркерной системы достаточно высок для того, чтобы использовать ее для идентификации и паспортизации сортов сои. Были идентифицированы 73 генотипа сои, в том числе 24 сорта селекции ВНИИМК, для каждого из них были получены уникальные наборы аллелей. На основании полученных данных об аллельном разнообразии изученных микросателлитных локусов разработаны молекулярно-генетические формулы, которые предложено использовать как соответствующие паспорта для идентификации и сертификации сортов сои.
Предлагаемая технология предназначена для решения таких задач, как поддержание генетических коллекций, подбор родительских пар для скрещиваний, регистрация новых сортов, контроль генетической подлинности сортов и защита прав селекционеров.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и региональных инвесторов (проект № 08-04-99058).
