Теоретические и практические подходы к созданию и применению новых протезирующих материалов на биологической основе для герниопластики способом IPOM

Введение. Синтетические протезы несколько десятилетий подряд прочно занимают свою нишу при выполнении широкого перечня реконструктивно-восстановительных и пластических операций. Стремительное развитие лапароскопических и роботических технологий не только упрочили их позицию, но и способствовали появлению целой индустрии, занимающейся усовершенствованием и созданием новых протезирующих материалов, вплоть до персонифицированных [1, 2]. В гер-ниологии использование имплантируемых протезов стало золотым стандартом ненатяжного закрытия дефектов передней брюшной стенки [3]. Однако поиски лучшего для этих целей материала и места для его имплантации относительно слоев передней брюшной стенки привели к разработке множества способов герниопластики, которых к настоящему времени насчитывается около 200 [4, 5]. Лидирующие позиции по числу выполняемых операций занимают IPOM и IPOM Plus, которые предполагают интраперитонеальное или ретромускулярное размещение протезирую- щего материала в проекции грыжевых ворот [6, 7]. Не менее 9 рандомизированных многоцентровых исследований убедительно обосновывают преимущества данных методов в связи с относительной технической простотой их выполнения, низкой частотой развития раневых осложнений, сером, послеоперационного болевого синдрома, рецидивов, более короткими сроками реабилитации при удовлетворительном качестве жизни пациентов в отдаленные сроки [8]. Возможными негативными последствиями остаются осложнения: свищи, адгезия или формирование спаек, миграция протеза и др. Большинство из них обусловлено специфическими свойствами поверхности протеза.

Эволюция IPOM началась с использования монофиламентных неабсорбирующих материалов на основе полипропилена, полиэстера, политетрафторэтилена, продолжилась разработкой композитных материалов (полипропилен + полидиоксанон + окисленная регенерированная целлюлоза, полипропилен + политетрафторэтилен и др.) и достигла этапа создания биологических материалов в виде специально обработанного подслизистого слоя тонкой кишки, мочевого пузыря, брюшины, дермы, как правило, ксеногенного происхождения [9, 10]. Опыт применения биологических протезов для герниопластики в клинике небольшой, а результаты противоречивы, поэтому при всей своей технологичности и перспективности они остаются наименее изученными [11].

Цель исследования. Получить, оценить безопасность, адгезивные свойства и ремезо-телизирующий потенциал ацеллюлярного дермального матрикса (АДМ) ксеногенного происхождения в условиях долгосрочной интраперитонеальной имплантации in vivo .

Материалы и методы. Получение АДМ. Образцы кожи человека получали при иссечении кожно-подкожного лоскута в ходе реконструктивно-восстановительных операций на органах брюшной полости и передней брюшной стенке. Кожные лоскуты отслаивали от подлежащей подкожно-жировой клетчатки и погружали в 0,9 % раствор натрия хлорида для предотвращения их высыхания. Для удаления эпидермиса использовали гипертонический раствор, содержащий 0,605 г основания Трис, 4 г NaCl, 0,202 г ЭДТА в 100 мл буферного фосфатно-солевого раствора (ФСР). Децеллюляри-зацию дермы человека проводили 2 % раствором дезоксихолата натрия (ДХН) (АppliChem) на дистиллированной воде в течение 48 ч со сменой раствора каждые 12 ч. Затем АДМ обезжиривали 0,07 % раствором липазы (Sigma-Aldrich), приготовленным на трис-HCl-соле-вом буферном растворе (ТСБ, рН 7,7) с добавлением 2 % раствора ДХН. Для удаления остаточного хроматина материал обрабатывали раствором ДНК-азы (Sigma-Aldrich) с активностью 40 ед./мл на ТСБ (рН 7.4) с добавлением 10 мМ МgCl2 при 37 °С. В течение 24 ч АДМ отмывали дистиллированной водой, а затем в течение 60 ч – ФСР. Деэпителизацию, децел-люляризацию и делипидизацию, за исключением удаления ДНК, проводили на орбитальном шейкере PSU-20i (Biosan, Латвия) в режиме 250 уд./мин при комнатной температуре. Полученные лабораторные образцы АДМ подвергали стерилизации в 3 сменах 70 % этилового спирта, который отмывали стерильным 0,9 % раствором хлорида натрия.

Анализ АДМ. Количество остаточной ДНК определяли на многофункциональном планшетном ридере Infinite 200 PRO (Tecan) согласно протоколу (DNA Quantitation Kit, Sigma-Aldrich, кат. № DNAQF).

Для определения остаточного количества нейтральных липидов в АДМ использовали унифицированный метод определения триглицеридов по глицерину после проведения пробоподготовки материала протеиназой К (Sigma-Aldrich) при 60 °С.

Для оценки содержания белков в составе АДМ в камере для вертикального электрофореза VE-20 (Helicon) проводили электрофорез в полиакриламидном геле по системе Лэммли. Полученные гели окрашивали кумасси G-250. В качестве стандартов молекулярной массы использовали Thermo ScientificTM Rage-RulerTM Brad Range Unstained Protein Laddеrs.

Идентификацию β-актина проводили методом вестерн-блоттинга c использованием мышиных моноклональных антител соответствующей специфичности (Clone AC-15, Sigma-Aldrich) и вторых антител (CloneA-5906, Sigma-Aldrich), меченных пероксидазой хрена, согласно стандартному протоколу (General Protocol for Western Blotting, Bulletin 6376, Bio-Rad). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли с помощью Trans-Blot Turbo Transfer System (BioRad). В качестве положительного стандарта для β-актина использовали культуру фибробластов человека.

Морфологическую структуру полученного биологического протезирующего материала изучали на гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, при помощи световой и поляризационной микроскопии.

Имплантация АДМ выполнена лабораторным крысам (n=18) обоего пола массой 250±30 г. Исследование соответствовало всем этическим принципам и нормам проведения биомедицинских экспериментов с участием животных и одобрено локальным этическим комитетом ЧУО ОВО «Медицинский университет «Реавиз» (протокол № 1 от 23.09.2022). Содержание лабораторных животных осуществляли в полном соответствии с действующими регламентами, при свободном доступе к воде и полнорационному корму. Для анестезии и аналгезии применяли тилетамина гидрохлорид и золазепама гидрохлорид в соотношении 1:1 из расчета 3 мкг/кг, вводимые парентерально на фоне предварительной седации кси-лазина гидрохлоридом в дозировке 2 мкг/кг. Эвтаназию осуществляли путем введения летальной дозы (с превышением в 2–2,5 раза средней дозы с учетом массы животного) тех же препаратов.

Ремезотелизирующий потенциал АДМ изучен путем оценки экспрессии HBME-1 – маркера мезотелиальных клеток после постановки иммуногистохимических реакций (ИГХ) при помощи моноклональных мышиных антител (клон HBME-1, Dako), которым предшествовал процесс восстановления антигена в 10 мМ цитратном буфере (рН 6,0). Для иммуногистохимической детекции была выбрана система DAKO EnVision™ + HRP (Dako North America, Inc. Carpinteria).

Результаты. Структура и состав АДМ. АДМ полностью повторял фибриллярную структуру дермы человека. При этом коллагеновые волокна сосочкового слоя дермы были тонкими, но плотно переплетенными, а сетчатый слой представлен различающимися по толщине фибриллами. Клетки и их компоненты в структуре АДМ отсутствовали (рис. 1).

Рис. 1. Морфологическая структура АДМ человека.

Окраска гематоксилином и пикросириусом красным, ×10

Fig. 1. Morphological structure of human ADM. Hematoxylin and picrosirius red staining, ×10

По данным биохимического исследования, нейтральные липиды в составе образцов АДМ отсутствовали. Электрофоретическое разделение белков матрикса показало, что основным его компонентом является коллаген (белковые фракции с молекулярной массой около и более 150 кДа). Других полос на электрофореграммах, свидетельствующих о наличии иных белков в составе образцов, выявлено не было (рис. 2а). вестерн-блоттинг демонстрировал отсутствие белка цитоскелета фибробластов – β-актина (рис. 2б).

Рис. 2. Состав АДМ: а) электрофореграмма белков нативной дермы (н) и АДМ (д) в полиакриламидном геле, стандарты молекулярной массы (с) и культуры фибробластов (кл); б) вестерн-блоттинг на β-актин нативной дермы (н), АДМ (д) и культуры фибробластов человека (кл)

Fig. 2. ADM composition: a) electrophoresis of proteins of native dermis (н) and ADM (д) in polyacrylamide gel, molecular weight standards (c) and fibroblast culture (кл); b) Western Blot for β-actin of native dermis (н), ADM (д) and human fibroblast culture (кл)

Гистологическое исследование АДМ вместе с окружающими тканями показало, что к этому сроку коллагеновые волокна исследуемых образцов полностью сохранялись, а их межфибриллярные пространства содержали в умеренном количестве мигрирующие к центру клетки – лимфоциты, макрофаги, тучные клетки и фибробласты, при этом на периферии присутствовали многочисленные тонкостенные капилляры с эритроцитами в просвете.

Рис. 3. Структура коллагеновых волокон АДМ после эксплантации на 90-е сут.

Окраска гематоксилином-пикросириусом красным. Поляризационная микроскопия, ×40

Fig. 3. Structure of ADM collagen fibers after 90-day explantation. Hematoxylin-picrosirius red staining.

Polarization microscopy, ×40

На противоположной стороне АДМ, ориентированной в полость брюшины, только к 90-м сут было идентифицировано формирова- ние слоя мезотелиальных клеток, определяемого по выраженной цитоплазматической и мембранной экспрессии ими HBME-1 (рис. 4).

А/А

Б/B

Fig. 4. HBME-1 expression by mesothelial cell membranes: a) in intact mesothelial cells of the serous membrane of the rat stomach. x40; b) on the surface of implanted xenogeneic ADM (90 days), ×10

Обсуждение. У 14 % пациентов в течение двух лет после IPOM-герниопластики развивается спаечная кишечная непроходимость, из них у 2,6 % она требует проведения экстренной операции, во время которой возникает до 11 % непреднамеренных энтеротомий, при этом у 53 % пациентов после адгезиолизиса спайки развиваются вновь [12]. У 83 % пациентов симптомы спаечной болезни брюшной полости приобретают хронический характер, что значительно ухудшает качество их жизни [13]. Причиной адгезивных процессов в брюшной полости является в том числе имплантированный материал, представляющий собой обширную поверхность, лишенную мезотелия. В целях компенсации в организме инициируется каскад процессов, ведущих либо к формированию неоперитонеума, либо к развитию спаек.

Особенностью регенеративных процессов на поверхности имплантированных материалов является восстановление слоев брюшины (в большей степени не с краев, а диффузно) за счет флотирующих мезотелиальных клеток, которые способны прикрепляться к поверхности протеза [14]. Большинство применяемых в настоящее время синтетических имплантов для герниопластики имеет гидрофобную ан-тиадгезивную поверхность, на которую дополнительно может наноситься антиадгезив- ное покрытие в виде мембран или вязких гелей, что сдерживает либо препятствует формированию неоперитонеума. Основной проблемой остается краткосрочность создаваемых антиадгезивных барьеров в связи с короткими сроками их биорезорбции и более длительным периодом полного восстановления мезотелиального слоя брюшины. Поэтому большинство антиадгезивных гелей или покрытий в составе материала может быть рассмотрено как временная профилактическая и далеко не всегда эффективная мера при IPOM-герниопластике.

Комплексным решением проблемы могут стать биологические протезы на основе аллогенных и ксеногенных тканей. В последние годы произошел значительный прогресс в технологиях создания биологических материалов для герниопластики [15].

В ходе экспериментального исследования был получен ксеногенный протез на основе дермы человека. Для клинического применения предполагается создание идентичного материала из дермы свиней. Обязательным условием безопасности в настоящем исследовании являлось полное удаление всех клеток и их фрагментов, а также нейтральных липидов и значимое снижение количества ДНК. При этом контроль полноты удаления всех клеточных компонентов осуществлен при помощи комплекса методов, включая морфологический, а оценка целостности коллагеновых фибрилл и их организация изучена при помощи поляризационной микроскопии. Данные электрофореграмм подтвердили, что основным компонентом АДМ был коллаген при отсутствии белка цитоскелета фибробластов β-актина, который известен как мощный индуктор аутоиммунных процессов [16].

Таким образом, полученный по разработанной технологии АДМ является безопасным, не проявляет адгезивных свойств при интраперитонеальной имплантации и обладает достаточным ремезотелизирующим потенциалом in vivo, что позволяет рассматривать его в качестве перспективного биологического протеза для герниопластики способом IPOM.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Пономарева Ю.В., Сарбаева Н.Н.

Литературный поиск, участие в исследовании, обработка материала: Королев М.В.,

Милякова М.Н., Столяров С.А.

Анализ и интерпретация данных: Пономарева Ю.В., Королев М.В.

Написание и редактирование текста: Пономарева Ю.В., Сарбаева Н.Н., Королев М.В.,

Милякова М.Н., Столяров С.А.