Термостабильность пероксидаз семян сои

Введение. Устойчивость живых систем является фундаментальной характеристикой организма. Она проявляется в стабильности и надежности его структурного состояния, химического, физического и компонентного состава, а также в постоянстве и стабильности общих закономерностей его индивидуального развития.     Надежность     растительного организма определяется его способностью не допускать нарушений структурной организации и функциональной активности клеток в условиях экологического стресса, который может различаться по природе, интенсивности и продолжительности воздействия [1]. Если компенсаторные силы организма способны противостоять воздействию, то метаболическая система организма после окончания воздействия возвращается к исходному уровню, быстро восстанавливает возникшие нарушения, мобилизуя свой адаптационный потенциал. Предупреждение или устранение отрицательных последствий стрессовых факторов на организм обеспечивается системой антиоксидантной защиты, в том числе рядом антиоксидантных ферментов, к которым относится пероксидаза [1].

Среди физиолого-биохимических факторов защиты растений от стрессовых воздействий пероксидазу рассматривают как одну из важнейших каталитических систем, активно участвующих в авторегуляции метаболизма при стрессе. Влияние экстремальных факторов среды, в т.ч. высоких температур, приводит к активации пероксидазы в различных тканях и органах живых систем. Установлено, что при температурных прогревах, не убивающих клетку, возможны процессы, способствующие восстановлению нарушенных структур и функций [2].

Многие растения обладают выраженной устойчивостью к действию экстремальных температур, но обычно она не является их постоянным свойством, а формируется в процессе воздействия некоторых тепловых условий. При настройке адаптационных систем растительные организмы приобретают способность переносить экстремальную теплообеспе-ченность. Кроме естественных температур, ферменты могут кратковременно выдерживать более высокие температуры, что характеризует термоустойчивость фермента. Важную роль в условиях температурного стресса играет микроокружение фермента в клетке. Установлено, что не только величина действующей температуры, но и ее колебания в течение времени обуславливают повреждения растений [2].

У растений имеется широкий набор изоформ пероксидазы. Спектр форм пероксидаз характеризуется весьма высокой лабильностью, что дает основание отнести ее к маркерам физиологического состояния растений [3]. Множественные формы пероксидаз представляют собой мономерные белки, которые кодируются разными генами. Некоторые формы могут быть продуктами одного гена, возникающими в результате модификации на посттранскрипционном/посттрансляцион-ном уровнях [4]. Разнообразие множест- венных форм пероксидаз – результат изменений аминокислотного состава белковой части молекулы фермента, состава углеводной части или агрегации низкомолекулярных форм фермента [3].

Большая часть форм пероксидаз семян сои имеет среднюю электрофоретическую подвижность [5]. Множественные формы осуществляют разные функции в растении: одни участвуют в процессах роста, другие выполняют защитную роль, обеспечивая растению возможность в условиях стрессовых факторов получать энергию, необходимую для поддержания жизнедеятельности. Множественные формы энзима, работающие в растении в различные периоды роста и развития, характеризуются тем, что способны окислять разные субстраты и действуют при неодинаковых условиях окружающей среды. Перестройка ферментной системы обеспечивает устойчивость организма к воздействию внешних факторов и регуляцию гомеостаза. Потенциальные возможности растения по устойчивости к неблагоприятным условиям среды реализуются под действием экстремального фактора достаточной напряженности, не превышающей порогового значения. Адаптация растений к экстремальным воздействиям среды – сложный комплекс процессов, координируемых системой саморегуляции организма [3].

Изучение термоустойчивости ферментов и белков в последействии стресса несет важную информацию, т.к. в его основе лежат изменения свойств макромолекул. Однако данных относительно термостабильности ферментов сои, и ее связи с жаро- и засухоустойчивостью недостаточно. Мало изучено влияние условий среды на активность пероксидазы сои.

В связи с вышеизложенным, цель нашей работы – изучить термостабильность пероксидаз семян сои в условиях температурного стресса.

М атериалы и методы. Семена сои сорта Соната ( Glycine max (L.) Merr.) получены из ГНУ ВНИИ сои РАСХН (г. Благовещенск, Амурская область).

Для изучения термоустойчивости пероксидаз семена сои прогревали в течение 15 минут при температуре от 20 до 200 ^о С с интервалом 10 ^о С (предварительный прогрев), а затем дополнительно эти же семена проращивали в течение 5 ч при температуре 45 ^о С (температурный стресс). Обработанные таким образом семена сои далее проращивали в течение 48 ч при нормальных условиях, что позволило проверить последействие температурного стресса на активность пероксидаз семян сои и термоустойчивость фермента.

Удельную активность пероксидаз определяли колориметрическим методом по А.Н. Бояркину в модификации А.Т. Мок-роносова [6], содержание белка – методом Лоури [7]. Для анализа множественных форм пероксидаз осуществляли разделение белков методом электрофореза в 7,5 %-ном полиакриламидном геле в щелочной буферной системе (рН 8,9). Локализацию форм пероксидаз устанавливали по относительной электрофоретической подвижности (ОЭП). Проявление пероксидаз проводили с использованием в качестве субстрата бензидина [8].

Р езультаты и обсуждение. В результате проведенных исследований установлено, что в процессе 15-минутного прогрева семян сои, начиная от 20 ^о С с увеличением температуры, активность пероксидазы постепенно снижается, и только при высокой температуре – 200 ^о С составляет 25 % от величины начальной активности фермента (рис. 1), что значительно выше, чем для ряда других растений [2]. Полученные данные позволяют сделать вывод, что пероксидаза семян сои является термостабильным ферментом.

Выявлено, что предварительный прогрев семян сои приводит к изменению термостабильности пероксидазы при их проращивании в условиях температурного стресса (рис. 1б). При предварительном прогреве семян в течение 15 минут при температуре 70 и 110 оС и дальнейшем прогреве при температуре 45 оС в течение 5 часов (температурный стресс)

фермент является наиболее термостабильным. Установлено, что в период последействия температурного стресса (рис. 1в), при предварительном температурном прогреве в диапазоне температур от 20 до 70 оС активность пероксидазы возрастает, и максимум активности фермента семян сои наблюдается после температурного прогрева величиной в 70 оС. Дальнейшее увеличение температуры (до 200 оС) при предварительном прогреве приводит к постепенному снижению активности пероксидаз семян сои в период последействия стресса, и при 200 оС активность пероксидаз составляет 25 % от величины начальной активности (рис. 1в).

Рисунок 1 – Зависимость удельной активности пероксидазы семян сои от температуры: а – после прогрева семян в течение 15 минут (прогрев); б – после дальнейшего прогрева в течение 5 ч при температуре 45 ^о С (температурный стресс); в – через 48 ч после действия температурного стресса (последействие стресса).

Значительный интерес представляет то, что прогревание семян сои влияет на компонентный состав множественных форм пероксидаз. При этом появляются новые или исчезают ранее присутствовавшие в спектре формы пероксидаз (рис. 2–4). Анализ электрофоретических спектров пероксидаз показал, что 15-минутный прогрев семян сои при разных температурах приводит к незначительному изменению множественных форм фермента (рис. 2). Максимальное количество форм пероксидаз выявлено в контроле и при невысоких температурах до 40 оС. При дальнейшем увеличении температу- ры происходит уменьшение количества форм пероксидаз (1–2 формы). В условиях до 80 оС происходит исчезновение высокомолекулярных форм П18, П15, дальнейшее увеличение температуры до 180 оС приводит к исчезновению формы П17, и остается только одна форма – П13, что, возможно, связано с высокой термоустойчивостью данной формы.

К 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 130 140 150 160 170 180 190 200

Температура, град,

Рис унок 2 – Схемы энзимограмм пероксидаз семян сои после 15-минутного прогрева при разных температурах.

Воздействие высоких температур в течение 15 минут и дальнейшее прогревание семян сои в течение 5 часов при температуре 45 оС (температурный стресс) приводит к изменению количества и появлению новых форм фермента (рис. 3).

К 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 130 140 150 160 170 180 190 200

Температура, град.

Рисунок 3 – Схемы энзимограмм пероксидаз семян сои после 15-минутного прогрева при разных температурах и дополнительного прогревания семян в течение 5 часов при температуре 45 ^о С.

Установлено, что прогрев семян сои в условиях температурного стресса способствует восстановлению фракционного состава белков, что соответствует литературным данным [2]. При температуре 70 и 110 оС выявлено наибольшее количество множественных форм фермента, отсутствующих при кратковременном прогревании и в контроле, что свидетельствует о высоком адаптационном потенциале сои. Причиной усложнения спектра может быть следствие агрегации молекул, изменения их заряда и другие причины, которые отражают перестройки в клетках при прогреве растений [3]. Прогревание при 180–190 оС не приводит к увеличению форм, а, наоборот, к обеднению спектра, что, по-видимому, является следствием процесса денатурации фермента. Нами выявлено, что после прогревания семян сои при 200 оС в течение 15 минут остается только одна форма пероксидазы П13 со средней электрофоретической подвижностью, и дальнейшее прогревание при температуре 45 оС в течение 5 ч не приводит к исчезновению данной формы. Следовательно, установлено, что форма пероксидазы П13 – самая термоустойчивая из всех выявленных форм в данном эксперименте.

К 20 30 40 50 60 70 80 30 100 110 120 130 140 150 160 170 180 130 200

Темп ература, град

Рисунок 4 – Схемы энзимограмм пероксидаз семян сои в период последействия стресса (через 48 ч после 15-минутного прогрева при разных температурах и дополнительного прогревания в течение 5 ч при температуре 45 °С).

Увеличение количества форм пероксидаз наблюдается и через 48 ч после воздействия стресса. Усложнение электрофоретических спектров пероксидаз может быть следствием агрегации молекул, изменением их заряда, изменением состава углеводной компоненты. Эти изменения, в конечном счете, отражают изменение активности генов в клетках при прогреве семян. Таким образом, прогрев семян сои приводит к изменению количества множественных форм пероксидаз, что, вероятно, увеличивает термоустойчивость сои.

В ыводы. Из полученных данных можно заключить, что реакция сои на температурный стресс при предварительном прогреве при разных температурах имеет качественно различный характер, следовательно, механизмы обеспечения их устойчивости, которые выражаются в изменении активности пероксидазы, неодинаковы. Это может быть связано с синтезом стресс-белков, в том числе пероксидаз, которые выполняют защитные функции. Увеличение количества множественных форм пероксидаз является следствием процесса адаптации сои к температурному стрессу. Выявлено несколько форм пероксидаз семян сои с высокой термоустойчивостью.