Тест-модель и количественный критериальный показатель для оценки антимикробного потенциала наноматериалов, используемых для водоочистки и водоподготовки: обоснование и метрологическая оценка

терий, дрожжеподобных и плесневых грибов, вирусов), а также бактериальных биопленок [19–22]. Поэтому использование наноматериалов представляет значительный интерес для обеззараживания воды систем питьевого водоснабжения [23–28].

Однако экспериментальные данные об антимикробной активности наноматериалов имеют противоречивый и часто лишь качественный/полуколи-чественный характер. Разнообразие методических приемов моделирования, отсутствие стандартных протоколов испытаний для внедрения в практику аккредитованных лабораторий, а главное – отсутствие обоснованного критериального аппарата количественной оценки антимикробного действия наноматериалов не позволяют провести анализ массива экспериментальных данных в соответствии с требованиями надлежащей лабораторной практики GLP , который предполагает строгое соблюдение протокола выполнения теста с оптимизированными условиями и параметрами для обеспечения получения сравнимых и достоверных данных [19, 29–32].

Целью настоящей работы было методологической обоснование и разработка унифицированной и стандартизованной тест-модели, оптимизация параметров методики и обоснование критериального аппарата для количественной оценки антимикробной активности наноматериалов, применяемых в условиях водоочистки и водоподготовки, а также их апробация на инновационных наноматериалах.

Материалы и методы. В работе использовали штаммы Escherichia coli АТСС 8739 и Staphylococcus aureus АТСС 25923, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Музейные штаммы микроорганизмов обладали типичными морфологическими, культуральными и физиологобиохимическими признаками соответствующих таксономических групп бактерий, а также хорошими ростовыми свойствами.

Для получения стандартизованных тест-моде-лей проводили культивирование в пробирках на 50 мл с 10 мл среды при температуре 35-37 ° С в течение 18–24 часов до достижения стационарной фазы роста на оптимизированной среде следующего состава: мясопептонный бульон – 500 мл, глюкоза – 10,0 г; CaCO 3 – 1,0 г; MgSO 4 – 0,2 г; CaCl 2 – 0,02 г; FeCl 3 – 0,02 г; раствор микроэлементов 10%-ный – 0,01 мл на 1000,0 мл, рН 7,2–7,4. Готовили разведение суспензии тест-культуры по оптическому стандарту мутности Фарланда до рабочей концентрации клеток Log 2 КОЕ/мл в физиологическом растворе.

Для апробации разработанной методики использовали образцы на основе наноструктурирован-ного диоксида титана (TiO 2 ), нанесенного на различные подложки, полученные с использованием различных технологических приемов. Образцы любезно предоставлены профессором В.Е. Борисенко, научным руководителем Центра наноэлектроники и новых материалов учреждения образования «Белорусский государственный университет информатики и радиоэлектроники», г. Минск.

Дизайн модельного эксперимента. Антимикробный потенциал образцов наноматериалов на основе диоксида титана (TiO 2 ) изучали в условиях прямого контакта образцов со стандартизованной суспензией тест-культур. В стерильный стеклянный стакан, содержащий 50 мл стандартизованной тест-культуры, помещали образцы наноматериалов размером 3,5×3,5 см², экспонировали в течение 30 минут с одновременной активацией лампой видимого света Model: 01200100011 (EL-PL10PW, 50 Гц, 10 Ватт, тип G23D, color – purm white). Оценку численности популяции микроорганизмов после воздействия осуществляли методом посева 0,1–1,0 мл суспензии на поверхность дифференциально-диагностических питательных сред: Эндо для E. coli , желточно-солевого агара – для S. aureus . Посевы культивировали при оптимальной температуре 35-37 ° С в течение 18–36 часов.

Обработка результатов измерений. Для количественной оценки после инкубирования подсчитывали типичные сформированные колонии на трех параллельных чашках Петри, содержащих не более 250 колоний. Рассчитывали количество микроорганизмов, КОЕ /мл, по формуле (1):

N

V 1

где N – количество типичных колоний на чашке; V 1 – объем посеянной пробы (0,1–1,0 мл).

За окончательный результат измерения принимали среднее арифметическое значение результатов пяти параллельных измерений.

Проверку приемлемости двух результатов единичных измерений, полученных в условиях повторяемости, осуществляли, рассчитывая абсолютное расхождение между десятичными логарифмами результатов единичных измерений, значение которого сравнивали со значением предела повторяемости ( r ).

Если для значения абсолютного расхождения между десятичными логарифмами двух результатов единичных измерений выполнялось условие (2)

I lg Х 1 - lg Х ₂| <  r ,                (2)

то оба результата единичных измерений считали приемлемыми.

Проверку дисперсий на однородность, статистические разбросы и выбросы выполняли по критерию Кохрена.

Расчет стандартного отклонения повторяемости проводили по формуле (3)

p

Sr = \ Е

V i = 1

( У п - У, 2 ) 2 2 p

Значение предела повторяемости r рассчитывали по формуле (4)

r = 2,8 Sr .                  (4)

Для количественной оценки антимикробного действия введен термин «антимикробный потенциал» и обоснован показатель R DDS , рассчитываемый по формуле (5)

Lg 0 - Lg 30

R DDS =            ,              (5)

Lg ₀

где Lg 0 – десятичный логарифм численности популяции перед воздействием;

Lg 30 – десятичный логарифм численности популяции после 30 мин воздействия.

Для метрологической оценки методики рассчитывали стандартное отклонение повторяемости и предел повторяемости согласно требованиям законодательной метрологии1. При вычислениях исключали результаты подсчета с числом колоний более 250 КОЕ/чашку.

Результаты и их обсуждение. Статистические данные для оценки метрологических характеристик метода получены по результатам анализа образцов пяти серий измерений, выполненных в разное время в условиях повторяемости (таблица). В условиях разработанной стандартной методики и на основании критерия RDDS был рассчитан антимикробный потенциал инновационных наноматериалов. Приме- нена разработанная критериальная шкала оценки антимикробного потенциала материала:

• 1,0 ≥ RDDS > 0,7 – выраженный антимикробный потенциал;

• 0,7 ≥ RDDS > 0,5 – средний антимикробный потенциал;

• 0,5 ≥ RDDS > 0,1 – незначительный антимикробный потенциал;

RDDS ≤ 0,1 – отсутствие антимикробного потенциала.

Таким образом, хотя различная устойчивость представителей водной микробиоты к воздействию наноструктурированных материалов отмечена в работах ряда авторов [8, 18, 32–35], нами впервые количественно оценен антимикробный потенциал по критерию R DDS [36–38].

Установлено, что в соответствии с предложенной критериальной шкалой антимикробное воздействие более выражено в отношении грамотрицательной микрофлоры, чем в отношении грамположительной. Выявлено также, что воздействие наноматериалов приводит к изменению фенотипических свойств, характерных для тест-культур. Тест-культура Escherichia coli АТСС 8739 изменяла тинкториальные свойства,

Результаты тестирования антимикробного потенциала R DDS образцов наноматериалов*

Образец	Escherichia coli АТСС 8739					Staphylococcus aureus АТСС 25923
	Lg 0	Х ср ± Sr r	Lg 30	Х ср ± Sr r	R DDS	Lg0	Х ср ± Sr r	Lg 30	Х ср ± Sr r	R DDS
1	2,39	2,35 ± 0,058 0,162	0	0 ± 0,00 0,00	1,00 – выраженный	2,32	2,32 ± 0,029	0,30	0,18 ± 0,16 0,448	0,92 – выраженный
	2,34		0			2,36		0,30
	2,44		0			2,29		0,30
	2,31		0			2,33		0,00
	2,30		0			2,30		0,00
2	2,39	2,37 ± 0,033 0,092	2,08	2,09 ± 0,067 0,188	0,12 – незначительный	2,32	2,30 ± 0,024 0,067	2,04	2,15 ± 0,098 0,274	0,07 – незначительный
	2,35		2,10			2,29		2,05
	2,41		2,00			2,27		2,25
	2,32		2,18			2,30		2,23
	2,36		2,12			2,33		2,18
3	2,38	2,36 ± 0,06 0,168	1,70	1,65 ± 0,134 0,375	0,30 – незначительный	2,35	2,35 ± 0,02 0,056	1,79	1,75 ± 0,05 0,018	0,25 – незначительный
	2,40		1,83			2,36		1,81
	2,34		1,53			2,33		1,73
	2,28		1,68			2,38		1,74
	2,36		1,51			2,33		1,68
4	2,34	2,34 ± 0,061 0,171	1	0,82 ± 0,117 0,328	0,65 – средний	2,29	2,26 ± 0,049 0,138	1,18	1,01 ± 0,11 0,308	0,55 – средний
	2,34		0,70			2,27		1,08
	2,44		0,85			2,30		0,95
	2,27		0,48			2,26		0,95
	2,32		0,90			2,18		0,90
5	2,38	2,38 ± 0,01 0,028	2,39	2,37 ± 0,05 0,14	0,003 – отсутствие	2,21	2,26 ± 0,11 0,308	2,22	2,27 ± 0,12 0,336	–0,002 – отсутствие
	2,38		2,34			2,23		2,24
	2,38		2,44			2,12		2,11
	2,37		2,31			2,37		2,37
	2,36		2,36			2,38		2,39

П р и м е ч а н и е : – представлены данные в виде среднего пяти измерений; Sr – стандартное отклонение повторяемости; r – предел повторяемости.

что приводило к вариабельности окраски по Граму, изменялась типичная форма вегетативных клеток и уменьшался их размер.

Впервые осуществлена метрологическая оценка операционных характеристик разработанного метода количественной оценки антимикробного потенциала наноматериалов. Рассчитаны показатели стандартного отклонения повторяемости ( Sr ) и предела повторяемости ( r ) с учетом приемлемости результатов единичных измерений, полученных в условиях повторяемости, проведена проверки дисперсий на однородность, статистические разбросы и выбросы, выполненная по критерию Кохрена.

Выводы. В ходе разработки методологии количественной оценки антимикробного потенциала наноматериалов обоснованы следующие стандартные условия проведения исследований и разработан стандартный протокол проведения испытаний:

• 1.    Для моделирования реальных параметров водоподготовки тестирование должно проводиться в условиях прямого контакта наноматериалов с суспензией микроорганизмов в физиологическом растворе. Такой прием, в отличие от использования агаризован-ных пластин, обеспечивает однородное распределение активных компонентов в толще водных сред и позволяет избежать искажения результатов испытаний путем устранения эффектов экранирования тест-культур органическими компонентами питательных сред и способности наноматериала к диффузии в плотные среды.

• 2.    Этапом оценки является экспозиция тест-культуры и образца наноматериала в условиях фотоактивации видимым светом в течение 30 минут. Предложенные условия являются достаточными для проявления антимикробных эффектов наноматериалов с различным, в том числе средним и слабым, потенциалом. С целью оценки динамики антимикробного эффекта может быть выбрана иная экспозиция.

• 3.    Биологическими тест-моделями являются эпидемически значимые музейные штаммы Escherichia coli АТСС 8739 и Staphylococcus aureus АТСС 25923, при этом Escherichia coli является палочковидной грамотрицательной бактерией, а Staphylococcus aureus – представитель кокковой грамположи-тельной микрофлоры. Предложенные штаммы представлены в рутинной практике аккредитованных микробиологических лабораторий, так как являются стандартными для оценки активности дезинфектантов и антисептиков, для определения ростовых свойств питательных сред, в том числе в соответствии с международными стандартами.

• 4.    Необходимой является строго стандартизованная подготовка музейных тест-культур для обес-

• печения репрезентативных и воспроизводимых результатов, так как наибольший вклад в неопределенность при проведении тестирования вносит нестандартизованная тест-культура.

• 5.    Целевая концентрация тест-культур должна быть подобрана таким образом, чтобы моделировать реальную микробную нагрузку в питьевой воде, составляющую 2 lg КОЕ/мл.

• 6.    Рабочая поверхность образцов должна составлять 3,5×3,5 см², что является оптимальным параметром для выявления антимикробного потенциала.

• 7.    Для количественной оценки антимикробного действия введен термин «антимикробный потенциал» и обоснован показатель R DDS , рассчитываемый по формуле (5)

• 8.    В целях практического использования предложена критериальная шкала оценки:

• 1, 0 ≥ R DDS > 0,7 – выраженный антимикробный потенциал;

• 0,7    ≥ R DDS > 0,5 – средний антимикробный потенциал;

• 0,5    ≥ R DDS > 0,1 – незначительный антимикробный потенциал;

Lg ₀ - Lg ₃₀ , R DDS =

Lg ₀

где Lg 0 – десятичный логарифм численности популяции перед воздействием;

Lg 30 – десятичный логарифм численности популяции после 30 мин воздействия.

R DDS ≤ 0,1 – отсутствие антимикробного потенциала.

При R DDS = 1 тестируемые наноматериалы проявляют максимально возможный антимикробный потенциал, R DDS = 0 – отсутствие антимикробного потенциала, R DDS < –0,3 – стимулирующая микроорганизмы активность.

Предложенные подходы и критериальная шкала могут быть широко применены в практике оценки антимикробной активности новых материалов, применяемых при водоподготовке и очистке питьевой воды.

Исследование выполнено при финансовой поддержке задания 3.05 «Исследовать свойства нанобио-структурных сенсоров и носителей и провести оценку их биоактивности и цитотоксичности» ГПНИ «Конвергенция-2020» Государственного комитета по науке и технологиям Республики Беларусь.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.