Тинкториальные свойства белковых растительных добавок

В настоящее время в мясной промышленности одной из задач является расширение ассортимента производимой продукции. При этом важно не только создать продукт, отвечающий спросу потребителей, но и сократить потери при производстве, для получения наибольшей выгоды. Для этого существует большое количество технологий, используемых в мясной промышленности, включая разработку различных белковых добавок, для сохранения питательности и удешевления мясных изделий, при сохранении их качества. С целью разработки новых немясных добавок изучаются различные животные и растительные компоненты, такие как молочные и сывороточные белки, белки на основе соединительных тканей. В литературе показана их роль в улучшении вкуса, цвета и текстурных свойств мясных продуктов [1, 2], а также способность связывать воду и жир для улучшения текстуры продукта [3]. Одно из наиболее частых используемых растений в качестве дополнительного источника белка – соя [ 437] . Эта культура содержит все незаменимые аминокислоты, кроме метионина и цистеина, содержит редкую жирную кислоту омега-3 [5]. Полагают, что соевый белок равнозначен белку куриного яйца или молока, и, следовательно, соя является лучшим источником для получения изолятов растительных белков [6].

На основе бобов сои получают следующие продукты: соевую муку (содержание белка (50–65% белка), концентрат соевого белка (SPC) (65–90% белка) и изолят соевого белка (SPI) (более 90% белка) [7].

Наибольшее распространение получил изолят соевого белка. Он получил широкое применение в пищевой промышленности, помимо использования в мясной промышленности для приготовления различных видов колбас и ветчин, его включают в смеси для детского питания, рекомендуемые для младенцев с непереносимостью белков коровьего молока [8]. Этому способствовали положительные качества этого продукта, такие как гелеобразующие свойства, влагоудерживающая способность, создание вязкости [9, 10]. Применение соевого изолята улучшает физико-химические свойства фарша для колбасных изделий [9], стабилизирует свойства мясных продуктов, повышает влагосвязывающую способность и липкость мясного фарша. Благодаря ему формируется густота и сочность продукта. По своим функциональным и технологическим свойствам изолят соевого белка действует аналогично структурообразующим мышечным белкам нежирного мяса [5].

Применение соевого изолята в рецептуре может способствовать увеличению выхода продукции [5, 11]. В некоторых случаях использование соевого изолята позволяет снизить использование жировой ткани [12]. Возможно применение изолята соевого белка для исправления качественных характеристик мясного сырья [2].

Обладая очевидными технологическими преимуществами, соя и ее продукты вызывают опасения в связи с некоторыми факторами. Например, для получения соевых белков в виде изолята или концентрата, бобы проходят многоступенчатую обработку, связанную с экстрагированием жира и удалением углеводов, применением растворителей и щелочей, что вызывает обеспокоенность их влиянием на здоровье потребителей [7].

В литературе нет однозначного мнения о влиянии сои, соевых продуктов и соевого белка на здоровье человека [13]. В качестве примеров положительного воздействия отмечают снижение уровня холестерина, липопротеинов низкой плотности и предотвращение рака [6, 14]. В то же время производные сои довольно часто вызывают аллергию [15]. Соевые бобы содержат много аллергенных белков, а именно липоксидазу, глицинин и β-глицинин, образующийся из глобулинов [16, 17]. Описаны негативные воздействия соевых протеинов на почки, печень, железы внутренней секреции [15].

Таким образом, необходимо регулировать количество сои и других растительных добавок (например, из гороха, пшеницы, риса) и их упоминание на этикетках товаров, чтобы избежать фальсификации и рисков, связанных со здоровьем потребителей [18].

Следовательно, необходим поиск способов выявления растительных добавок (например, изолята соевого белка) для контроля качества мясной продукции. Существует несколько способ идентификации растительных добавок. Самые известные из них полимеразная цепная реакция (ПЦР), иммуноферментный анализ и гистологический метод [17, 19]. Используя гистологический метод, можно увидеть растительные структуры, которые сильно отличаются от мышечных волокон и явно свидетельствуют о наличии растительных добавок в продукте.

Согласно ГОСТу 31474–2012 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок» в гистологических исследованиях применяется гематоксилин и эозин, а по ГОСТу 31479–2012 «Мясо и мясные продукты. Метод гистологической идентификации состава» используется также судан III вместе с перечисленными красителями.

Гематоксилин окрашивает базофильные структуры клетки ярко-синим цветом [20], он достаточно устойчив к кислотным растворам, чтобы участвовать в гистологических методах с несколькими этапами. Эозин окрашивает эозинофильные клеточные структуры красно-розовым цветом, а судан используются для окрашивания триглицеридов в замороженных срезах и некоторых липидов, связанных с белками, и липопротеинов на парафиновых срезах.

Тинкториальные свойства растительных добавок мало освещены в литературе [21], но выявление этих компонентов в продуктах питания имеет важное значение при качественной оценке мясных изделий, как гарант безопасности для потребителя [22].

Цель работы – провести исследование микроструктурных и тинкториальных свойств растительных белковых добавок.

Материалы и методы

Результаты

При использовании гематоксилина и эозина ярко окрашены, как фрагменты белковых добавок, так и мышечная ткань на всех образцах. Жир прокрашивается суданом III и имеет ярко оранжевую окраску. При применении гематоксилина и судана III (без эозина) можно наблюдать жировые включения, но мышечная ткань менее интенсивна окрашена, так как гематоксилин, являясь основным ядерным красителем, хорошо прокрашивал ядерные структуры и слабо саркоплазму волокон. Если использовать все три красителя, то все структуры ярко окрашены, и видны жировые включения.

ГОСТ 31474–2012 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок» описывает соевый изолированный белок как частицы, окрашенные в розовый цвет, округлой формы с отверстием внутри. Также могут встречаться частицы в виде гантели, цветка. Результаты нашего исследования окраски изолята соевого белка гематоксилином и эозином, представленные на рисунке 1, показывают, что форма частиц данной добавки отличается большим морфологическим разнообразием. Размеры частиц могут варьировать от нескольких до сотни микрометров. Встречаются частицы округлой, гантелевидной формы. Кроме того, встречаются частицы неправильной, произвольной формы или формы цветка. Но для всех частиц характерно наличие отверстия внутри. Больше воспринимают основные красители, окрашиваются базофильно при использовании гематоксилин-эозина и при дополнительном докрашивании суданом. При отсутствии эозина добавка имеет более светлый фиолетовый цвет. Это подтверждает, что соевый изолированный белок воспринимает гематоксилин.

Гороховый протеин, представленный на рисунке 2, представляет собой частицы разнообразной формы: округлые, овальные, гантелевидные, сложной формы. Во всех фрагментах внутри присутствует отверстие, повторяющее форму самой частицы. Окрашивание гематоксилином и эозином показывает, что частицы больше прокрашиваются гематоксилином и имеют фиолетовый цвет. При отсутствии эозина частицы прокрашиваются гематоксилином в слабо фиолетовый цвет. Размер частиц так же очень вариабельный, встречаются и небольшие фрагменты около 5 мкм, много фрагментов среднего размера, встречаются некоторые фрагменты размером около 100 мкм.

Рисунок 1. Фрагменты изолированного соевого белка в мясном фарше (увеличение в 400 раз): А – окраска гематоксилином и эозином; В – окраска гематоксилином и суданом III; С – окраска гематоксилином, эозином и суданом III; 1 – фрагменты изолята соевого белка; 2 – мышечная ткань; 3 – жир.

Figure 1. Isolated soy protein fragments in minced meat (400х magnification): A – hematoxylin and eosin staining; B – hematoxylin and sudan III staining; C – hematoxylin, eosin and sudan III staining; 1 – fragments of the isolated soy protein; 2 – muscle tissue; 3 – fat.

Рисунок 2. Фрагменты горохового протеина в мясном фарше (увеличение в 400 раз): А – окраска гематоксилином и эозином; В – окраска гематоксилином и суданом III; С – окраска гематоксилином, эозином и суданом III; 1 – фрагменты изолята горохового белка; 2 – мышечная ткань; 3 – жир.

Figure 2. Fragments of pea protein in minced meat (400х magnification): A – hematoxylin and eosin staining; B – hematoxylin and sudan III staining; C – hematoxylin, eosin and sudan III staining; 1 – fragments of the isolated soy protein; 2 – muscle tissue; 3 – fat.

На рисунке 3 представлены фотографии при разных методах окрашивания рисового протеина в мясном фарше. Фрагменты добавки представлены глыбками многоугольной формы разного размера, без полости внутри. Структура частиц негомогенная, зернистая. При окрашивании гематоксилин-эозином и при докрашивании суданом фрагменты протеина окрашиваются оксифильно в ярко-розовый цвет. При отсутствии эозина фрагменты остаются бесцветными.

Рисунок 3. Фрагменты рисового протеина в мясном фарше (увеличение в 400 раз): А – окраска гематоксилином и эозином; В – окраска гематоксилином и суданом III; С – окраска гематоксилином, эозином и суданом III; 1 – фрагменты рисового протеина; 2 – мышечная ткань; 3 – жир.

Figure 3. Fragments of rice protein in minced meat (400х magnification): A – hematoxylin and eosin staining; B – hematoxylin and sudan III staining; C – hematoxylin, eosin and sudan III staining; 1 – fragments of the isolated soy protein; 2 – muscle tissue; 3 – fat.

Обсуждение

При всех используемых в оценке качества мясных продуктов методах окрашивания, соевый изолят и гороховый протеин демонстрирует похожую картину. Фрагменты добавок отличаются большим полиморфизмом. Можно встретить разнообразные формы от округлой и овальной до неправильной, встречаются формы в виде гантели или цветка. Особенность этих добавок обязательное наличие отверстия внутри фрагмента, чаще всего отверстие напоминает форму самой частицы. В каждом окрашивании чётко прослеживаются структуры добавки, которые проявляют базофилию. Эозин очень слабо прокрашивает фрагменты в розовый цвет, частицы обладают большим сродством к гематоксилину. При отсутствии эозина фрагменты хорошо прокрашиваются гематоксилином, эозин же дает более розовый фон, не меняя окраску кардинально. Это противоречит описаниям данной добавки в исследованиях других авторов [21]. Возможно, такие противоречия обусловлены использованием разных видов гематоксилина.

Морфологически частицы соевого изолята и горохового протеина очень похожи друг на друга, что объясняется близким родством данных ботанических видов. Незначительной особенностью горохового протеина является то, что в добавке встречается больше частиц округлой формы, чем в соевом изоляте. Вероятность идентифицировать эти две добавки в составе готового продукта гистологическим методом мала, для подтверждения необходимы дополнительные методы исследования, такие как ПЦР метод. Сходная морфологическая картина дает возможность недобросовестным производителям добавлять в продукт гороховый протеина, который достаточно редко используется по сравнению с соевым. При этом стандартным ПЦР анализом на сою эта добавка не сможет быть выявлена.

Рисовый протеин морфологически очень сильно отличается от бобовых. Его форма, отсутствие отверстия и тинкториальные свойства позволяют его легко идентифицировать от изолята бобовых. Он окрашивался оксифильно только там, где применялся эозин, без использования эозина оставался бесцветным. Это говорит о том, что рисовый протеин обладает основными свойствами, в отличие от бобовых.

Заключение

Наши исследования белковых добавок из бобовых растений выявили их морфологическое сходство и похожие тинкториальные свойства. Фрагменты соевого изолята и горохового протеина имеют разнообразную форму с округлыми очертаниями с отверстием внутри. Воспринимают гематоксилин, окрашиваются базофильно в фиолетовый цвет. Незначительным морфологическим отличием горохового протеина является большее количество частиц с округлой формы. Таким образом гистологическая идентификация добавок из сои и гороха является затруднительной.

Фрагменты рисового протеина имеют форму многоугольных глыбок, неоднородной структуры без отверстия. Окрашиваются только эозином.

В нашей работе мы столкнулись с несоответствием выявленных свойств окрашивания добавок соевого изолята и горохового протеина данным других исследований. Противоречие полученных нами данных о способности соевого изолята и горохового протеина воспринимать гистологические красители говорит о том, что изучение тинкторные свойства данных добавок является актуальным и, возможно, возникнет необходимость корректировок нормативных актов.

Выражаем благодарность фирме Summit Ingredients Co., Ltd. за предоставленные для исследований образцы добавок.