Ультраструктура остеоапатита ветви нижней челюсти крыс после 60‑суточной затравки натрия бензоатом либо тартразином и коррекции препаратами Мексидол либо Тиотриазолин

EDN: DWLAIW

Кроме пищевой промышленности, бензоат натрия используется в парфюмерной [2], химической промышленности, машиностроении и медицине [3]. По данным ряда исследований, бензоат натрия может оказывать генотоксический [4], мутагенный, цитотоксический и канцерогенный эффекты (данные о последнем противоречивы) [5]. Отмечаются также аллергические реакции и активация процессов перекисного окисления липидов [6]. Существует множество исследований перечисленных эффектов бензоата натрия, однако исследования, связанные напрямую с его влиянием на систему скелета на органном или тканевом уровне, отсутствуют. Наряду с пищевыми добавками в пищевой промышленности активно используются и пищевые красители как природного происхождения, так и синтетические. Они используются для восстановления естественного цвета продуктов, утраченного во время обработки, а также для усиления естественного цвета продуктов или изменения такового. Одним из таких красителей является тартразин. Некоторые исследования предполагают наличие у тартразина побочных эффектов, таких как генотоксичность [7], канцерогенность, аллергенность, гепатотоксичность, комплексообразование с рядом ионов металлов-микроэлементов, гематотоксичность и нарушение функционирования антиоксидантной системы [8]. При этом, как и в случае с бензоатом натрия, среди множества исследований, результатом которых является обнаружение множественных побочных эффектов тартразина, исследования, направленные на изучение непосредственного влияния тартразина на систему скелета, практически отсутствуют [9].

Цель — выявить изменения ультраструктуры остеоапатита ветви нижней челюсти (ВНЧ) у белых крыс в период реадаптации после 60-суточного введения бензоата натрия либо тартразина и обосновать возможности коррекции выявленных изменений мексидолом либо тиотриазолином.

Материал и методы. Эксперимент был осуществлен на 245 самцах белых крыс с исходной массой тела в диапазоне 200-210 г, разделенных на различные группы: контрольная группа КБК состояла из животных, не подвергавшихся воздействиям; группы НБ1000 и ТТЗ1500 включали крыс, которым осуществляли внутрижелудочное введение 1 мл натрия бензоата в дозе 1000 мг/кг/сут либо 1 мл тартразина в дозе 1500 мг/кг/сут; группы НБ1000М, БН1000Т, ТТЗ1500М и ТТЗ1500Т составили крысы, которым одновременно с введением натрия бензоата или тартразина производили внутрибрюшинное введение препарата Мексидол в дозе 50 мг/кг/сут либо препарата Тиотриазолин в дозе 117,4 мг/кг/сут. В ходе исследования использовались следующие вещества: натрия бензоат, произведенный Eastman Chemical

BV (Нидерланды); мексидол — ООО «Медицинский центр «Эллара»» (Россия) по лицензионному соглашению с ООО «Научно-производственная компания «Фармасофт»», Москва, регистрационное свидетельство №UA/1348/02/01; тиотриазолин, выпускаемый ООО «Озон» (Россия), №ЛП-006907-070421. Дозировка препаратов рассчитывалась в соответствии с рекомендациями Ю.Р. и Р. С. Рыболовлевых [10].

Животные содержались в условиях вивария ФГБОУ ВО «Луганский государственный медицинский университет им. Святителя Луки» Минздрава России в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, Хельсинкской декларацией 1964 г. и ее поправками 2024 г., а также в соответствии с приказом Минздрава России от 18.05.2021 №464н «Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований». Протокол исследования был одобрен на заседании локального независимого этического комитета ФГБОУ ВО ЛГМУ им. Св. Луки Минздрава России (протокол № 4 от 18.12.2023).

По истечении каждого срока наблюдения (3, 10, 15, 24 и 45 сут) из каждой группы по 7 экземпляров были подвергнуты декапитации под общим наркозом. Был выделен нижний челюстной отдел, отделен височно-нижнечелюстной сустав (ВНЧ), прокаливался в муфельной печи при температуре 650°C и исследовался на аппарате ДРОН-2,0 с гониометрической приставкой ГУР-5. Использовалось Кα-излучение меди с длиной волны 0,1542 нм; параметры использования составляли напряжение 30 кВ и анодный ток 20 А. Дифрагированные рентгеновские лучи фиксировались в угловом диапазоне от 2 до 37°, со скоростью записи 1° за 1 мин. На полученных дифрактограммах анализировались наиболее выраженные дифракционные пики биоминерала кости. По угловым координатам этих пиков рассчитывались размеры кристаллитов согласно уравнению Селякова — Шерера, а также параметры элементарных ячеек минерала и коэффициент микротекстурирования по методу анализа соотношения рефлексов.

Для статистической обработки данных использовали программу Statistica 10.0 (Statsoft, USA), при этом применяли методы вариационной статистики, включая вычисление средних значений ( M ), оценку вероятности расхождений ( m ) и проверку значимости изменений с использованием t -критерия Стьюдента. Разность средних значений признавалась значимой при р <0,05. Для проверки нормальности распределения использовали тест Шапиро — Уилка.

Результаты. Выявлено, что 60-суточная затравка лабораторных животных натрия бензоатом в дозе 1000 мг/кг/сут либо тартразином в дозе 1500 мг/кг/сут приводила к нарушению процессов минерализации костного матрикса. К 3-м суткам после завершения затравки параметры элементарных ячеек остеоапатита ВНЧ по осям а и с , а также размеры кристаллитов в группе НБ1000 превосходили аналогичные в группе КБК на 0,19, 0,23 и 5,83%, а в группе ТТЗ1500 — на 0,22, 0,25 и 7,72% соответственно. Это является признаками нестабильности структуры кристаллической решетки остеоапатита ВНЧ. Однородность кристаллической решетки также нарушалась, о чем свидетельствует снижение коэффициента микротекстурирования в группах НБ1000 и ТТЗ1500 на 8,38 и 10,35%.

Рис. 1. Динамика изменений размеров кристаллитов в группах НБ1000 и ТТЗ1500, нм. Здесь и далее на рис. 2: *различия по отношению к контрольной группе статистически значимы.

Рис. 2. Динамика изменений коэффициента микротекстурирования в группах НБ1000 и ТТЗ1500

С увеличением срока, прошедшего после окончания затравки, структура остеоапатита ВНЧ постепенно стабилизировалась. В группе НБ1000 параметры элементарных ячеек по осям а и с продолжали оставаться больше значений группы КБК на 0,18 и 0,23% к 10-м суткам периода реадаптации, на 0,15 и 0,17% — к 15-м суткам и на 0,11 и 0,15% — к 24-м суткам. Размеры кристаллитов в группе НБ1000 стабилизировались несколько раньше и превосходили показатели группы КБК на 6,55% к 10-м суткам периода реадаптации и на 5,13% — к 15-м суткам, как показано на рис. 1.

Однородность структуры остеоапатита ВНЧ в группе НБ1000 также стабилизировалась, хотя и отставала от значения группы КБК дольше: на 7,80% к 10 суткам, на 8,43% к 15 суткам, на 6,82% к 24 суткам и на 5,57% к 45 суткам периода реадаптации, как показано на рис. 2.

После окончания затравки тартразином процессы минерализации костного матрикса в период реадаптации также стабилизировались, но медленнее, чем после затравки натрия бензоатом.

В группе ТТЗ1500 параметры элементарных ячеек остеоапатита ВНЧ по осям а и с , а также размеры кристаллитов, продолжали оставаться больше значений группы КБК на 0,24, 0,28 и 8,37% к 10-м суткам, на 0,19, 0,25 и 7,79% — к 15-м суткам, на 0,16, 0,24 и 7,17% — к 24-м суткам и на 0,12, 0,14 и 5,86% — к 45-м суткам периода реадаптации. Динамика изменений размеров кристаллитов в данной группе представлены на рис. 1.

Коэффициент микротекстурирования остеоапатита ВНЧ в группе ТТЗ1500 отставал от значений группы КБК на 10,66% к 10-м суткам, на 10,15% — к 15-м суткам, на 9,73% — к 24-м суткам и на 7,86% — к 45-м суткам периода реадаптации, что также отражено на рис. 2.

Таким образом, 60-суточная затравка лабораторных животных натрия бензоатом в дозе 1000 мг/кг/сут либо тартразином в дозе 1500 мг/кг/сут приводит к нарушению процессов формирования остеоапатита ВНЧ и однородности его кристаллической решетки. В обоих случаях данные явления выражены в максимальной степени сразу после окончания затравки, а в дальнейшем постепенно стабилизируются.

В группе НБ1000 к 45-м суткам реадаптации сохраняются статистически значимые отличия от значений группы КБК только некоторых исследуемых показателей, а в группе ТТЗ1500 — всех изучаемых параметров микроструктуры остеоапатита ВНЧ.

Применение препаратов Мексидол и Тиотриазолин одновременно с затравкой животных натрия бензоатом и/либо тартразином сопровождалось признаками менее значимого повреждения структуры остеоапатита ВНЧ.

В группе НБ1000М к 15-м и 24-м суткам после окончания затравки натрия бензоатом коэффициент микротекстурирования превышал значения группы без предварительной коррекции на 4,26 и 3,65%.

После применения препарата Тиотриазолин параметры элементарных ячеек по оси а с 3-х по 45-е сутки были меньше значений группы НБ1000 на 0,10, 0,15, 0,13, 0,13 и 0,12%, а размеры вдоль оси с — с 10-х по 24-е сутки — на 0,16, 0,19 и 0,17%. Размеры кристаллитов были меньше, чем в группе НБ1000 с 10-х по 45-е сутки реадаптации на 4,8, 5,38, 9,15 и 5,25%, а коэффициент микротекстурирования превышал значения группы без коррекции с 3-х по 45-е сутки на 5,97, 6,25, 5,74, 5,97 и 5,87%.

У животных группы ТТЗ1500М коэффициент микротекстурирования превышал значения группы без предварительной коррекции к 15-м и 24-м суткам на 4,26 и 3,65% соотвественно.

После применения препарата Тиотриазолин параметры элементарных ячеек остеоапатита ВНЧ по оси а в группе ТТЗ1500Т с 3-х по 45-е сутки реадаптации были меньше значений группы без предварительной коррекции на 0,1, 0,15, 0,13, 0,13 и 0,12%, а параметры элементарных ячеек по оси c с 10-х по 24-е сутки — на 0,16, 0,19 и 0,17%. Размеры кристаллитов с 10-х по 45-е сутки реадаптации также были меньше значений группы без предварительной коррекции ТТЗ1500 на 4,8, 5,38, 9,15 и 5,25%. Коэффициент микротекстурирования с 3-х по 45-е сутки реадаптации превышал значения группы ТТЗ1500 на 5,97, 6,25, 5,74, 5,97 и 5,87%.

Обсуждение. Нарушения формирования кристаллической решетки при воздействии бензоата натрия или тартразина, вероятно, обусловлены их про-окислительной активностью, которая вызывает появление множества свободных радикалов. Образование и накопление свободных радикалов, в свою очередь, приводит к смещению окислительно-восстановительного баланса и вызывает окислительный стресс. Результатом развития окислительного стресса является усиление апоптоза остеоцитов и остеобластов, а также стимуляции дифференцировки остеокластов [11]. Не исключено и прямое влияние свободных радикалов на биоминерал костной ткани, хотя сведения о таком влиянии отсутствуют. Развитие нарушений на 3-и сутки может свидетельствовать об активном окислительном стрессе, вызванном как бензоатом натрия, так и тартразином. Применение препарата Мексидол в данных условиях показывает, что статистически достоверные изменения наблюдаются только на 15-е и 24-е сутки. Эффект развивается замедленно и на поздних сроках не проявляется, что позволяет предположить ограниченное влияние препарата на формирование кристаллической решетки костного минерала. При назначении препарата Тиотриазолин статистически достоверные изменения проявляются на 3-й день и отмечаются во все сроки наблюдения. Таким образом, препарат Тиотриазолин обладает выраженной эффективностью при хроническом употреблении бензоата натрия или тартразина, превосходящей эффективность препарата Мексидол. Возможной причиной более выраженного эффекта может являться наличие тиольной группы у препарата Тиотриазолин, хотя могут существовать и иные причины.

Заключение. Внутрижелудочное введение натрия бензоата в дозе 1000 мг/кг/сут приводит к нарушению структуры кристаллической решетки гидроксиапатита ветви нижней челюсти с незначительными признаками стабилизации на поздних сроках. Нарушения структуры выражаются в увеличении размеров элементарных ячеек и кристаллитов и уменьшении коэффициента микротекстурирования. Введение 5% раствора препарата Мексидол в дозе 50 мг/кг/сут путем внутрибрюшинного способа на протяжении 60 дней в сочетании с натрием бензоатом приводит к признакам восстановления ультраструктуры биоминерала ветви нижней челюсти, что наблюдается на 15-е и 24-е сутки периода реадаптации. При этом регистрируется рост коэффициента микротекстурирования. Использование препарата Тиотриазолин в дозе 117,4 мг/кг/сут на фоне введения натрия бензоата также демонстрирует признаки восстановления ультраструктуры биоминерала ветви нижней челюсти, проявляющиеся с 3-х до 45-х суток реадаптации, причем наблюдается не только увеличение коэффициента микротекстурирования, но и уменьшение размеров элементарных ячеек гидроксиапатита и кристаллитов.

Введение тартразина в дозе 1500 мг/кг/сут путем использования внутрижелудочного метода вызывает более выраженные и устойчивые нарушения кристаллической структуры минерала ветви без признаков восстановления. В этом случае фиксируется увеличение размеров элементарных ячеек и кристаллитов гидроксиапатита, а также снижение коэффициента микротекстурирования. Введение препарата Мексидол в дозе 50 мг/кг/сут на фоне тартразина, также осуществляемое внутрибрюшинным способом в течение 60 сут, приводит к проявлениям восстановления ультраструктуры биоминерала ветви нижней челюсти, что наблюдается на 15-е и 24-е сутки периода реадаптации. При этом увеличивался только коэффициент микротекстурирования. Применение препарата Тиотриазолин в дозе 117,4 мг/кг/сут в течение 60 сут одновременно с воздействием тартразина сопровождается восстановлением ультраструктуры биоминерала ветви нижней челюсти, которое выражено с 3-х по 45-е сутки периода реадаптации. Здесь изменения выражались как в уменьшении элементарных ячеек и кристаллитов, так и в увеличении коэффициента микротекстурирования.

Препараты Мексидол и Тиотриазолин обладают положительным влиянием на формирование кристаллической решетки, выражающимся в восстановлении основных ее параметров при назначении на фоне хронического воздействии бензоата натрия или тартразина.

Вклад авторов. Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.