Условия и сроки хранения разных препаративных форм микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов-антагонистов возбудителя белой гнили

Введение. Особую опасность для многих сельскохозяйственных растений, в т.ч. и масличных культур (подсолнечника, сои и рапса), представляет белая гниль Sclerotiniasclerotiorum (Lib.) DeBary. В регионе Северного Кавказа белая гниль особенно вредоносна в последние годы на озимом рапсе. Вредоносность болезни выражается в преждевременном усыхании растений, снижении урожая и ухудшении его качества.

В мире достаточно активно ведутся исследования с целью снижения вредоносности белой гнили на многих сельскохозяйственных культурах с использованием штаммов микробов-антагонистов [1–10], однако микробиопрепаратов на основе активных штаммов явно недостаточно.

В лаборатории биометода ВНИИМК создана уникальная коллекция перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепаратов, включающая штаммы грибов, относящихся к родам Penicillium, Chaetomium, Trichoderma, Sordaria, Gliocladium, Aspergillus, Fusarium, Talaromyces, и штаммы бактерий, относящихся к родам Bacillus и Pseudomonas, – антагонистовмногих заболеваний масличных и других сельскохозяйственных культур[11]. В результате ступенчатого скрининга из коллекции отобраны штаммы, активно разлагающие склероции белой гнили рапса и обладающие ростостимулирующей активностью к культуре рапса, –Xk-1-4 Chaetomium olivaceum и Б-12 Bacillus licheniformis [12].

В целях разработки элементов технологического регламента производства микробиопрепаратов на основе отобранных штаммов определяли условия и сроки хранения разных препаративных форм.

Материалы и методы. Исследования проводили на центральной экспериментальной базе, в лаборатории биометода ВНИИМК.

Опытные образцы разных препаративных форм микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов-антагонистов изготавливали в лаборатории биометода ВНИИМК. Испытывали препаративные формы: жидкая культура (ЖК) – при глубинном культивировании штаммов на искусственных питательных средах и порошок (П) в двух модификациях: при глубинном культивировании штаммов на жидкой питательной среде с последующим смешиванием отценрифугированной жидкой культуры с наполнителем перлит в соотношении 1:0,4 и 1:0,8 и при поверхностном культивировании штамма на твёрдой питательной среде с последующим смывом спор и смешиванием суспензии с наполнителем перлит (для штамма Xk-1-4 Chaetomiumolivaceum ). Для увеличения срока хранения препаративной формы ЖК испытывали стабилизаторы и питательные добавки: поливинилпироллидон (ПВП), гумат натрия, аскорбиновую кислоту, глицерин, хлористый магний, сульфат магния. Опытные образцы микробиопрепаратов хранили в холодильнике при температуре 10 ^оС и в условиях переменной температуры (18–25 ^оС) в лаборатории.

Титр во всех опытах определяли методом Коха [13]. Определение числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 мл или 1 г включает три этапа: приготовление разведений, посев на питательную среду в чашки Петри (ЧП) и подсчет выросших колоний. Для этого 1,0 мл ЖК или 1 г порошка стерильной пипеткой или шпателем переносили в колбу с 99,0 мл стерильной воды и ставили на качалку на 10–15 мин. Из полученной суспензии готовили разведение от 1 : 10 до 1 : 1000000000. Суспензию из соответствующего разведения закапывали по 1,0 мл в три чашки Петри (ЧП). Затем заливали в чашки по 15,0–20,0 мл агаризированной среды, остуженной до 45–50 °С, и смешивали питательную среду с посевным материалом легкими вращательными дви- жениями. ЧП ставили в термостат с оптимальной температурой и через 5–7 дней считали среднее число колоний в трёх ЧП.

Титр вычисляли по формуле:

Т = а х 10n / V, гдеТ – количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 мл/г;

а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;

• V – объем суспензии, взятый для посева; 10n – коэффициент разведения.

Результаты и обсуждение. Условия и сроки хранения микробиопрепарата на основе штамма гриба Хk-1-4 Chaetomium olivaceum в различных препаративных формах.

Препаративная форма ЖК, полученная при глубинном культивировании штамма гриба Хk-1-4 Chaetomiumolivaceum , имела титр 1,0–2,0 × 10⁷ КОЕ/мл и была технологична в применении. К сожалению, эта препаративная форма быстро теряла титр как в условиях холодильника (табл. 1), так и в условиях переменной температуры (табл. 2).

Таблица 1

Влияние стабилизаторов и сроков хранения микробиопрепарата на титр препаративной формы жидкая культура (глубинное культивирование штамма гриба Хk-1-4 Chaetomiumolivaceum) при температуре 10 оС г. Краснодар, 2012 г.

Стабилизатор, %		Титр, КОЕ/мл
		перед закладкой на хранение	через месяц	через двамеся-ца
Контроль без стабилизатора		1,2 × 107	1,0 × 106	4,0 × 105
ПВП	1,0	-//- *	1,2 × 106	4,5 × 105
	3,0	-//-	1,0 × 106	3,8 × 105
	5,0	-//-	3,5 × 106	1,9 × 106
Гуматнатрия	5,0	-//-	3,0 × 106	8,6 × 105
	10,0	-//-	3,0 × 106	1,0 × 106
	20,0	-//-	1,8 × 106	4,0 × 106
	50,0	-//-	1,8 × 106	3,9 × 105
Аскорбиновая кислота	0,1	-//-	1,0 × 107	4,8 × 106
	0,25	-//-	5,6 × 106	3,0 × 106
Глицерин	5,0	-//-	3,0 × 106	8,9 × 105
	10,0	-//-	3,5 × 106	1,0 × 106
Хлористый магний	5,0	-//-	2,0 × 106	8,0 × 105
	10,0	-//-	2,8 × 106	8,9 × 105
Сульфат магния	5,0	-//-	3,0 × 106	9,0 × 105
	10,0	-//-	3,5 × 106	1,0 × 106

* здесь и далее титр аналогичен контрольному без стабилизатора

Таблица 2

Влияние стабилизаторов и сроков хранения микробиопрепарата на титр препаративной формы жидкая культура (глубинное культивирование штамма гриба Хk-1-4 Chaetomiumolivaceum) при температуре 18–25 оС г. Краснодар, 2012 г.

Стабилизатор, %		Титр, КОЕ/мл
		перед закладкой на хранение	через месяц	через дваме-сяца
Контроль без стабилизатора		1,2 × 107	1,0 × 106	3,0 × 105
ПВП	1,0	-//- *	1,5 × 106	4,8 × 105
	3,0	-//-	8,0 × 105	3,9 × 105
	5,0	-//-	8,6 × 105	1,0 × 106
Гумат натрия	5,0	-//-	1,0 × 106	8,0 × 105
	10,0	-//-	3,0 × 106	1,9 × 106
	20,0	-//-	7,0 × 106	1,0 × 106
	50,0	-//-	3,0 × 106	3,9 × 105
Аскорбиновая кислота	0,1	-//-	1,5 × 107	9,0 × 106
	0,25	-//-	4,0 × 106	1,6 × 106
Глицерин	5,0	-//-	3,0 × 106	9,0 × 105
	10,0	-//-	3,8 × 106	3,0 × 106
Хлористый магний	5,0	-//-	1,8 × 106	5,9 × 105
	10,0	-//-	2,0 × 106	6,5 × 105
Сульфат магния	5,0	-//-	2,0 × 106	8,6 × 105
	10,0	-//-	1,8 × 106	3,0 × 106

* здесь и далее титр аналогичен контрольному без стабилизатора

Через два месяца хранения титр препарата в контроле, как в холодильнике, так и в условиях переменной температуры, снизился на два порядка (1,2 × 107 – 4,0 × 105 КОЕ/мл). Лучшими добавками установлены 0,1 % аскорбиновая кислота, 5,0 % ПВП и 10,0 % гумат натрия. В этих вариантах титр снизился на один порядок и составил 1,0–9,0 × 106 КОЕ/мл.

Микробиопрепарат в препаративной форме порошок на перлите хранился в условиях переменной температуры лучше жидкой культуры (табл.3).

Установлено, что в течение первого месяца хранения титр препарата для всех его модификаций, в зависимости от количества наполнителя и условий культивирования штамма, даже незначительно увеличивался. В дальнейшем, при хранении препарата в течение девяти месяцев, титр оставался с тем же порядком, что и перед закладкой на хранение. При этом титр препарата, полученного при выра- щивании на твёрдой питательной среде с последующим смывом спор и смешиванием суспензии с перлитом, был на порядок выше, чем у препарата, полученного при глубинном культивировании штамма с последующим смешиванием с наполнителем.

Таблица 3

Влияние срока хранения микробиопрепарата на основе штамма гриба Хk-1-4 Chaetomium olivaceum в препаративной форме порошок на титр в условиях переменной температуры г. Краснодар, 2012 г.

Вариант		Титр, КОЕ/г, при температуре 18–25 оС
		перед закладкой на хранение	через, месяцев
			1	3	6	9
Суспензия + перлит	1:0,8	8,7 × 106	2,0 × 107	8,5 × 106	2,0 × 106	1,0 × 106
	1:0,4	5,7 × 107	1,0 × 108	2,8 × 107	1,8 × 107	1,0 × 107
Глубинная-культур а + перлит	1:0,8	3,0 × 106	3,6 × 106	3,0 × 106	8,0 × 105	1,0 × 105
	1:0,4	6,6 × 106	7,0 × 106	7,0 × 106	2,5 × 106	8,5 × 105

Таким образом, наиболее перспективной препаративной формой микробиопрепарата на основе штамма гриба Хk-1-4 Chaetomiumolivaceum , технологичной при производстве, долго сохраняющей титр при переменной температуре, можно считать порошок на перлите, полученный смывом спор с твёрдой питательной среды с последующим смешиванием с наполнителем.

Условия и сроки хранения микробиопрепарата на основе штамма бактерии Б-12 Bacilluslicheniformis в различных препаративных формах.

Титр ЖК микробиопрепарата, получаемого при глубинном культивировании штамма бактерии Б-12 Bacillus licheniformis, был 1,0–2,0 × 1012 КОЕ/мл. Препаративная форма жидкая культура была технологична при применении, но также хранилась без изменения титра как в условиях холодильника, так и в услови- ях переменной температуры в течение месяца.

Для увеличения срока хранения препаративной формы ЖК нами испытывались стабилизаторы и питательные добавки. Биопрепарат хранили в холодильнике при температуре 10 °С (табл. 4) и в условиях переменной температуры (18–25 °С) в лаборатории (табл. 5).

Таблица 4

Влияние стабилизаторов и сроков хранения на титр микробиопрепарата на основе штамма бактерии Б-12 Bacillus licheniformisв препаративной форме жидкая культура (глубинное культивирование) при температуре 10 оС г. Краснодар, 2012 г.

Стабилизатор, %		Титр, КОЕ/мл
		перед закладкой на хранение	через, месяцев
			1	3	6
Контроль без стабилизатора		1,9×1012	2,0×1012	2,1×1011	7,0 × 109
ПВП	1,0	-//-*	2,3×1012	1,3×1011	1,2 × 1010
	3,0	-//-	1,1×1012	3,2×1011	8,3 × 1010
	5,0	-//-	2,5×1012	1,6×1011	1,1 × 1010
Гумат натрия	5,0	-//-	2,5×1012	2,1×1011	1,8 × 1010
	10,0	-//-	4,3×1012	3,0×1011	2,1 × 1010
	20,0	-//-	9,5×1012	2,1×1011	3,7 × 1010
	50,0	-//-	2,5×1012	1,8×1011	1,3 × 1010
Аскорбиновая кислота	0,1	-//-	2,6×1012	5,0×1011	9,3 × 109
	0,25	-//-	2,6×1012	1,6×1011	2,2 × 1010
Глицерин	5,0	-//-	6,0 × 1011	2,6×1011	1,4 × 1010
	10,0	-//-	2,0 × 1011	2,4×1011	2,3 × 1010
Хлористый магний	5,0	-//-	1,0 × 1011	2,3×1011	2,3 × 1010
	10,0	-//-	2,0 × 1011	2,5×1011	2,3 × 1010
Сульфат магния	5,0	-//-	5,0 × 1011	3,5×1011	1,3 × 1010
	10,0	-//-	9,0 × 1011	3,3×1011	1,4 × 1010

* здесь и далее титр аналогичен контрольному без стабилизатора

Установлено, что через месяц хранения ЖК в холодильнике титр в контроле не изменился, а в вариантах с 10,0 и 20,0 %гуматом натрия даже повысился (4,3 × 1012 КОЕ/мл и 9,5 × 1012 КОЕ/мл против 2,0 × 1012 КОЕ/мл в контроле).

Через три месяца хранения в условиях холодильника титр снизился как в контроле, так и во всех вариантах на один порядок. Лучшим вариантом отмечена добавка 0,1 % аскорбиновой кислоты, титр составил 5,0 × 1011 КОЕ/мл против 2,1×1011 КОЕ/мл в контроле.

Через шесть месяцев хранения ЖК в условиях холодильника титр препарата в контроле снизился на три порядка и составил 7,0 × 109 КОЕ/мл. Во всех вариантах с добавками титр был выше контроля на порядок и лучшими добавками установлены 20,0 %гумат натрия и 3,0 % ПВП– титр составил 3,7–8,3× 1010 КОЕ/мл.

При хранении ЖК микробиопрепарата на основе бактерии Б-12 Bacillus licheniformis в условиях переменной температуры лаборатории в течение месяца титр в контроле незначительно снизился, но остался на уровне 10¹² КОЕ/мл (табл. 5).

Таблица 5

Влияние стабилизаторов и сроков хранения на титр микробиопрепарата на основе штамма бактерии Б-12 Bacillus licheniformis в препаративной форме жидкая культура (глубинное культивирование) при температуре 18–25оС г. Краснодар, 2012 г.

Стабилизатор, %		Титр, КОЕ/мл
		перед закладкой на хранение	через, месяцев
			1	3	6
Контроль безстабилизатора		1,9 × 1012	1,0 × 1012	2,3 × 1011	6,3 × 109
ПВП	1,0	-//-	7,6 × 1012	1,3 × 1011	3,9 × 1010
	3,0	-//-	1,1 × 1012	1,2 × 1011	3,9 × 1010
	5,0	-//-	1,5 × 1012	1,7 × 1011	3,4 × 1010
Гумат-натрия	5,0	-//-	1,7 × 1012	1,5 × 1011	1,4 × 1010
	10,0	-//-	8,1 × 1012	9,7 × 1011	3,1 × 1010
	20,0	-//-	6,4 × 1012	2,2 × 1011	1,1 × 1010
	50,0	-//-	2,0 × 1012	5,2 × 1011	5,0 × 1010
Аскорбиновая-кислота	0,1	-//-	1,0 × 1012	1,0 × 1011	2,9 × 1010
	0,25	-//-	5,1 × 1012	5,0 × 1011	2,5 × 1010
Глицерин	5,0	-//-	3,0 × 1012	5,1 × 1011	3,5 × 1010
	10,0	-//-	2,3 × 1011	3,5 × 1011	3,1 × 1010
Хлори-стыймаг-ний	5,0	-//-	2,5 × 1011	3,3 × 1011	1,3 × 1010
	10,0	-//-	1,0 × 1011	4,0 × 1011	2,0 × 1010
Сульфат-магния	5,0	-//-	7,0 × 1011	6,7 × 1011	1,7 × 1010
	10,0	-//-	9,8 × 1011	6,8 × 1011	1,5 × 1010

* здесь и далее титр аналогичен контрольному без стабилизатора кислотой титр ЖК даже повысился и составил 5,1–8,1 × 1012 КОЕ/мл против 1,0 × 1012 КОЕ/мл в контроле.

Через три месяца хранения в условиях переменной температуры титр препарата в контроле снизился на порядок и составил 2,3 × 1011 КОЕ/мл. Лучшим вариантом установлен 10,0 % гумат натрия, титр составил 9,7 × 1011 КОЕ/мл.

Через шесть месяцев хранения ЖК препарата в условиях переменной температуры титр в контроле снизился на три порядка и составил 6,3 × 109 КОЕ/мл. Во всех вариантах с добавками титр был выше контроля на порядок, но лучшими определены 50,0 и 10,0 % гумат натрия, 1,0; 3,0 и 5,0 % ПВП, а также 5,0 и 10,0 % глицерин, где титр составил 3,1–5,0 ×

1010 КОЕ/мл.

Таким образом, установлено, что ЖК микробиопрепарата на основе бактерии Б-12 Bacilluslicheniformis можно хранить в условиях переменной температуры в течение шести месяцев с сохранением титра на уровне 10¹⁰ КОЕ/мл с добавкой 1,0 % ПВП или 10,0 % гумата натрия, или 5,0 % глицерина.

С целью увеличения срока хранения и возможности наработки микробиопрепарата на основе штамма бактерии Б-12 Ba-cilluslicheniformis в заводских условиях нами отрабатывалась препаративная форма порошок с добавлением перлита (табл. 6).

Таблица 6

Влияние срока хранения микробиопрепарата на основе штамма бактерии Б-12 Bacil-luslicheniformis в препаративной форме порошок на перлите на титр при температуре 18–25оС г. Краснодар, 2012 г.

Срок хранения, месяц	Титр, КОЕ/г
Перед закладкой на хранение	1,1×1011
1	2,9×1011
2	1,8×1011
3	3,7×1011
4	1,6×1010
5	1,3×1010
6	1,0×1010
9	1,0×1010

Установлено, что в течение первых трех месяцев хранения препаративной формы порошок на перлите в условиях переменной температуры в лаборатории титр не изменялся (1,1–2,9 × 1011 КОЕ/г). В дальнейшем, при хранении препарата в течение шести месяцев, происходило снижение титра, но он оставался высоким и составлял 1,0 × 1010 КОЕ/г.

Таким образом, наиболее технологичными препаративными формами микробиопрепарата на основе штамма бактерии Б-12 Bacillus licheniformis при производстве и хранении можно считать жидкую культуру при глубинном культивировании с добавкой ПВП или гу-мата натрия, или глицерина, а также порошок на перлите.

Выводы. 1. Для перспективных штаммов-антагонистов Xk-1-4 Chaetomium olivaceum и Б-12 Bacillus licheniformis разработаны препаративные формы микробиопрепаратов жидкая культура и порошок в двух модификациях.

• 2.    Жидкую культуру микробиопрепарата на основе штамма гриба Xk-1-4 Chaetomium olivaceum можно сохранить с титром на уровне 1,0–9,0 × 10⁶ КОЕ/мл в течение двух месяцев как в условиях холодильника, так и в условиях переменной температуры с добавкой 0,1 % аскорбиновой кислоты, 5,0 % ПВП и 10,0 % гумата натрия.

• 3.    Лучшей препаративной формой для микробиопрепарата на основе штамма гриба Хk-1-4 Chaetomiumolivaceum установлен порошок на перлите, полученный смывом спор с твёрдой питательной среды с последующим смешиванием с наполнителем, сохраняющий титр при переменной температуре на уровне 10⁷ КОЕ/мл в течение девяти месяцев.

• 4.    В отличие от грибного препарата, жидкую культуру микробиопрепарата на основе бактерии Б-12 Bacilluslicheniformis можно хранить в условиях переменной температуры в течение шести месяцев с сохранением титра

  на уровне 10¹⁰ КОЕ/мл с добавкой 1,0 % ПВП или 10,0 % гумата натрия, или 5,0 % глицерина.

• 5.    В препаративной форме порошок на перлите титр бактериального препарата сохранялся на уровне 10¹⁰ КОЕ/г в условиях переменной температуры в течение девяти месяцев.

Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ, грант 11-08-96512.