Варианты коррекции завышенных или заниженных значений химеризма, рассчитанных по разным локусам коротких тандемных повторов



Рисинская Н. В., Чабаева Ю. А., Судариков А. Б., Куликов С. М.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

ВАРИАНТЫ КОРРЕКЦИИ ЗАВЫШЕННЫХ ИЛИ ЗАНИЖЕННЫХ ЗНАЧЕНИЙ ХИМЕРИЗМА, РАССЧИТАНННЫХ ПО РАЗНЫМ ЛОКУСАМ КОРОТКИХ ТАНДЕМНЫХ ПОВТОРОВ

Введение. Анализ профилей коротких тации костного мозга остаётся «золотым» тандемных повторов для вычисления доли стандартом мониторинга химеризма. Метод ДНК донора и реципиента после трансплан- характеризуется высокой воспроизводимо- стью, достаточной чувствительностью для выявления более 1 % минорной ДНК в образце, однако точность метода колеблется в зависимости от выбора маркеров химеризма. Известно, что эффективность амплификации в полимеразной цепной реакции разных аллелей гетерозиготного локуса может не совпадать. Если мы выбираем в качестве информативного маркера менее эффективно амплифицируемый аллель реципиента и соотносим его с более эффективно ампли-фицируемым аллелем донора, рассчитанный по этим маркерам результат оказывается сильно заниженным. В обратной ситуации — более эффективно амплифицируемый аллель реципиента и менее эффективно амплифи-цируемый аллель донора — результат будет завышен. Поэтому доля ДНК реципиента,вы-числяемая в одном образце по разным маркерам, может флуктуировать в диапазоне 10 % и даже выше. Ещё одна причина завышения значений химеризма — совпадение маркера реципиента со статтер-пиком маркера донора. Такие маркеры принято не брать в расчет, однако в случае трансплантации от близкого родственника, когда выбор маркеров химеризма ограничен, других вариантов может просто не быть.

Цель . Исследование «поведения» гетерозиготных аллелей и пар статтер/маркер во времени для последующей коррекции завышенных и заниженных значений химеризма.

Материалы и методы. Был проведен ретроспективный анализ архивных файлов профилей коротких тандемных повторов пациентов с сохраняющимся полным донорским химеризмом после трансплантации костного мозга, проведенной в НМИЦ гематологии. Исследовано соотношение эффективностей амплификации (соотношение высот пиков) для 14 гетерозиготных локусов (n=5 D12S391, n=3 D10S124 , n=2 D1S1656, n=2 SE33, n=1 vWA, n=1 D16S529) у 11 пациентов в нескольких временных точках (от 5 до 14 в зависимости от времени наблюдения за пациентом после ТКМ) для каждого. Разница в длине амплифицируемых фрагментов была более пар нуклеотидов, что исключало возможное перекрытие со статтер-пиками друг друга. Кроме того,было исследовано соотношение высот пиков для 40 пар статтер/ пик-хозяин в линейках образцов донор/паци-ент после ТКМ (для пациента от 5 до 14 вре- менных точек при условии подтвержденного полного донорского химеризма).

Результаты . Для гетерозиготных локусов было показано, что соотношение эффективности ПЦР сохраняется во времени,и ампли-фикат более короткого аллеля составляет от 54 до 62 % от общего ПЦР продукта для данного локуса. Значит, можно ввести поправочный коэффициент для используемого в калькуляции химеризма маркера, учитывающий эффективность амплификации (к=высота пика более короткого амплифика-та/высота пика длинного амплификата). Для пар статтер/маркер-хозяин отношение стат-тера к суммарному сигналу статтера и информативного маркера сохраняется в воспроизводимых условиях проведения ПЦР. Причем информативный маркер может быть как основным пиком для этого статтера,так и реципрокным пиком в случае гетерозиготы. Для 11 из исследуемых маркеров, сопровождаемых статтерами, у 9 пациентов было проанализировано также по параллельных проб в последней временной точке. Средние значения доли статтеров и стандартные отклонения в параллельных пробах были близки к этим же параметрам для доли стат-тера в разных временных точках, т. е. флуктуации доли статтера во времени сопоставимы с ошибкой измерения. Вероятно, отношение высоты статтера к сумме высот статтера и основного пика является индивидуальной константой для каждого выбранного маркера химеризма. Определив долю статтера по образцу ДНК донора, можно использовать маркеры со статтерами для калькуляции химеризма. Нами было показано, что при вычитании доли статтера из рассчитанного значения химеризма результат занижается незначительно, но более корректно использовать формулу R=(A-stutter):(1-stutter), где R — истинное значение химеризма, А — химеризм до учета доли статтера, stutter — доля статтер-пика в общем сигнале.

Выводы . используя сохраняющееся во времени соотношение эффективности ПЦР двух аллелейвгетерозиготе,а так же константный характер доли статтер-пиков, можно вводить корректирующие поправки для более точного расчёта химеризма.