Видовая идентификация мясной продукции методом ПЦР

Использование современных достижений молекулярной биологии для решения задач контроля безопасности и качества пищевой продукции имеет большое практическое значение. Идентификация видовой принадлежности мясной продукции есть гарантия качества и безопасности продуктов питания, инструмент борьбы с фальсификацией. Известно, что мясные продукты, в большинстве своем, состоят из множества ингредиентов, что делает возможным их непреднамеренное или умышленное загрязнение неразрешенными составляющими. К тому же, часть потребителей отказывается от определенных видов мяса в силу культурных и религиозных особенностей [9].

В настоящее время существует растущий спрос на халяльную продукцию и увеличивается число поставщиков данной продукции. И при отсутствии идентификации продукции возникает риск фальсификации или несоответствия продукции заявленным требованиям.

Наиболее перспективным методом контроля мясной продукции является метод ДНК-диагностики – молекулярногенетический. В частности, общепринятая методика для видовой идентификации мясных ингредиентов животных и птицы в продуктах питания и сырье – это ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ, с детекцией продуктов амплификации), которая является недорогой, точной и качественной. Данный метод позволяет с высокой точностью выявить наличие искомого видоспецифичного фрагмента, присутствующего в образце в очень малом количестве [4, 5, 10].

Метод качественной ПЦР-РВ обладает высокой точностью, так его лимит определения разных видов мясных ингредиентов составляет от 3 геном-эквивалентов для детекции крупного и мелкого рогатого скота до 50 – для свиньи, курицы и индейки. В связи с высокой чувствительностью ПЦР-РВ может обнаружить следы ДНК определенного вида, что показывает о загрязнении мясной продукции ингредиентом, который, не указан в сертификате качества [5, 6, 8].

Для количественного определения ДНК-мишени применяются два высокоточных метода, это общепринятый и распространенный – ПЦР-РВ и цифровой капельный ПЦР с прямым подсчетом количества копий целевой ДНК в аналитической пробе. Последний является новым и является усовершенствованной полимеразной цепной реакцией, которая позволяет достоверно устанавливать абсолютное количество копий ДНК-мишени в образце с чувствительностью до 1 копии ДНК из 100 тыс. При этом данный метод имеет следующие преимущества по сравнению с ПЦР-РВ: возможность абсолютного количественного обнаружения числа копий идентифицируемого фрагмента ДНК или РНК по конечной точке реакции амплификации, устойчивость к ингибиторам полимеризации, независимость результата анализа от эффективности ПЦР, отсутствие необходимости построения стандартных кривых, использования контролей [2].

Поэтому актуальным является установление достоверности пищевых продуктов и выявление возможной фальсификации или при изготовлении, или подмене сырья, или добавлении более дешевых мясных продуктов.

Материал и методы исследований . Исследования проведены в Татарском филиале Федерального центра охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ») в 2024 году.

Материалом для исследований служили следующие пробы: меланж куриный, куриный фарш, рулет, пельмени, сосиски и колбасы, в состав которых входит курятина и свинина. Выделение ДНК из продуктов питания проводили с помощью набора реагентов «ДНК-Сорб-С-М» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора), далее проводили амплификацию методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) используя коммерческие тест-системы производства ООО «Синтол»:

• •    «Gallus gallus / Meleagris gallopavo Ident RT multiplex» для обнаружения видоспецифичной ДНК курицы (Gallus gallus) и индейки (Meleagris gallopavo);

• •    «Sus scrofa Ident RT» для обнаружения видоспецифичной ДНК свиньи (Sus scrofa);

Получение и обработка результатов ПЦР-РВ проводились с помощью прибора для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени «Rotor Gene 6000» (Австралия) и модулей измерительных CFX96 в составе термоциклеров для амплификации нуклеиновых кислот C1000 Touch (США).

Результат исследований . Для регулирования требований к сырью и продукции в России существует ГОСТ 31719-2012 «Продукты пищевые и корма.

Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)», который распространяется на определение видовой принадлежности мясных и растительных ингредиентов, содержащихся в кормах, пищевых продуктах, продовольственном сырье растительного, животного происхождения, в том числе подвергавшихся термической обработке. Данный стандарт применяется в аккредитованных лабораториях, занимающихся видовой идентификацией сырьевого состава методом ПЦР, в том числе и в Татарском филиале Федерального центра охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ»). В ФГБУ ВНИИЗЖ за 2023 г. проведено 338 испытаний в отношении продуктов питания и сырья, состоящих из мяса или включающих мясные компоненты, в том числе мясных ингредиентов крупного (быки) и мелкого рогатого скота (бараны/овцы/козы), домашней лошади, свиньи, курицы, индейки. В 2024 г. ФГБУ ВНИИЗЖ успешно подтвердило свою компетентность путем участия в межлабораторных сличениях по видовой идентификации мясных ингредиентов в образцах сложного многокомпонентного состава, а также прохождением и расширением области аккредитации.

Одно из главных требований к продуктам питания стандарта «Халяль» это отсутствие в них свинины и других видов животных (грызунов, собак и кошек). Требования к минимальному количеству запрещенного мяса зависит от системы сертификации. Но в большинстве случаев в халяльных продуктах допускается либо присутствие не более 1 % свинины, либо ее отсутствие на уровне чувствительности аналитических методик [1]. Поэтому для точного подтверждения количественного содержания мясных ингредиентов необходимо использовать методики высокоточного количественного определения видоспецифичной ДНК как в цельном мясе, так и для количественной оценки процентного соотношения фальсификатов к основному сырью в мясных продуктах питания сложного состава, в которых могут содержаться примеси различных видов мяса. Следовательно, возникает следующий важный вопрос – мультиплексирование ПЦР, то есть разработка метода ПЦР для одновременного прохождения нескольких реакций детекции видоспецифичной ДНК в одной пробирке, что позволит снизить стоимость данного метода и одновременно увеличить скорость выполнения работ [3, 7].

А

1

а

•

>

•

в

•

Well

♦ Fluor FAM FAM

Tar

’ Content Unkn Unkn Unkn

Sample     ♦ ФАРШ РУЛЕТ МЕЛАНЖ ЯИЧНЫЙ

Со N/A NA

•

и*

■м

«м

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

ПА»

•

мм

им

•м

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

Н05

с

им

им

<м

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

Н06

FAM

NA

9

мм

им

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

Н07

FAM

Unkn

ПЕЛЬМЕНИ

NA

а

мм

мм

мм

мм

ММ

мм

ММ

мм

мм

мм

мм

мм

Н08

FAM

Unkn

СОСИСКИ

N/A

*

им

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

мм

Н09

FAM

Unkn

КОЛБАСА

N/A

мм

мм

Н11

FAM

Neg Ctrl

ОКО

N'A

-

ММ

мм

мм

мм

Н12

FAM

Pos CM

ПКО

28.57

Канал, отвечающий за наличие ДНК индейки

Б

Кана.

АлфМкэЬол

1X0

J «О ш

Content Unkn Unkn Unkn Unkn Unkn Unkn

Neg Ctrl PosCtrl

Co ♦ 33.24 26.56 29.43 31.35 23.43 24.67

N/A 29.08

H11

Texas Red

Texas Red

Sample

ФАРШ РУЛЕТ

ПЕЛЬМЕНИ СОСИСКИ КОЛБАСА ОКО ПКО

Texas Red

Well

Н04

Н05

НО6

Н07 ное

Texas Red

Texas Red

Texas Rec

Texas Red

Texas Red

.ci Tar ♦ Fbor •

МЕЛАНЖ ЯИЧНЫЙ

л, отвечающий за наличие ДНК курицы

В

Рисунок 1 – Результаты испытаний образцов мясной продукции на наличие видоспецифичной ДНК курицы и индейки

А – Канал, отвечающий за наличие внутреннего контроля

Б – Канал, отвечающий за наличие ДНК индейки

В – Канал, отвечающий за наличие ДНК курицы

Для анализа видовой принадлежности мясного сырья и готовой продукции используются в практической работе в аккредитованной лаборатории, в том числе ФГБУ «ВНИИЗЖ», готовые тест-системы для определения ДНК таких видов животных, как курица, индейка, утка, гусь, страус, свинья, крупный рогатый скот, овца, коза, кролик, лошадь, кошка, собака. Они значительно упрощают выполнение и качественного, и количественного анализа и избавляют от необходимости приобретать дополнительные реагенты и референсные образцы ДНК, поскольку все эти компоненты входят в комплектацию систем. С помощью данных тест-систем можно определять примеси свинины от

0,01 %, и использование их позволяет соблюдать самые жесткие требования систем сертификации «Халяль», выявлять как случайное загрязнение свининой, так и намеренную фальсификацию сырья или готовой продукции.

С целью определения эффективности использования ПЦР для видовой идентификации мясной продукции были исследованы следующие опытные образцы: меланж куриный, мясной фарш, рулет, пельмени, сосиски и колбаса из мяса кур. На рисунке 1 представлены результаты испытаний образцов мясной продукции на наличие видоспецифичной ДНК курицы и индейки, которые проведены в ФГБУ ВНИИЗЖ. Внутренний контроль показал, что ПЦР проведена правильно и результаты можно считать достоверными. Канал, отвечающий за ДНК индейки показал, что в продукции мяса индейки не обнаружено. По каналу, отвечающему за наличие ДНК курицы, видно, что меланж яичный находится на 29,43 цикле. И все, что до данного цикла (меланж) – это, те продукты, как рулет, сосиски и колбаса, которые содержат ДНК курицы, количество ДНК, которых соответствует наличию в них мяса курицы. Все что после 29,43 цикла (меланж) это пельмени и фарш, которые содержат ДНК курицы, количество ДНК, которых менее ДНК меланжа, при этом наличие в них мяса курицы (продуктов убоя) отсутствует. Это говорит о том, что в сырьевой состав данных продуктов питания входят куриные яйца или яичная продукция.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что метод идентификации на основе ПЦР в реальном времени может применяться для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов.

Рисунок 2 – Результаты испытаний образцов мясной продукции на наличие видоспецифичной ДНК свиньи

На рисунке 2 представлены результаты испытаний образцов мясной продукции на наличие видоспецифичной

ДНК свиньи. Внутренний контроль показал, что ПЦР проведена правильно и результаты можно считать достоверными.

Канал, отвечающий за ДНК свиньи показал, что в сосисках и колбасе обнаружено ДНК свиньи, что говорит о наличии в них мяса – свинины, при этом в рулете курином наличие свинины не обнаружено.

Анализ практических возможностей применения метода идентификации на основе ПЦР показал необходимость и целесообразность его использования для определения видовой принадлежности мяса и мясных ингредиентов.

Заключение . Разработка отечественных технологий для идентификации мясной продукции имеет как инновационный, так и религиозный характер. Применение метода количественной ПЦР позволит различать умышленно произведенную подмену от технически неизбежного загрязнения пищевого сырья, возникающего в процессе технологической обработки мяса.

Применение метода идентификации мясной продукции на основе ПЦР необходимо и целесообразно для определения видовой принадлежности мяса и мясных ингредиентов в системе качества стандарта «Халяль».