Влияние аминогликозидных антибиотиков на патологию митоза в Allium-тесте

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

Аминогликозиды относятся к группе антибиотиков, блокирующих синтез белков [1–2] прокариот. Механизм действия этих препаратов обусловлен их необратимым связыванием со специфическими рецепторами бактериальных рибосом (30S-субъединицей рибосом), что прекращает биосинтез белка, и нарушением синтеза цитоплазматических мембран, что приводит к гибели бактериальных клеток. Аминогликозиды повышают сродство аминоацил-тРНК к А-сайту, что ведет к связыванию ошибочных, не соответствующих кодону матрицы аминоацил-тРНК и обусловливает ошибки при считывании генетической информации. В результате в пептидную цепь включаются необычные аминокислоты и синтезируются неактивные молекулы белка [1–3].

Аминогликозиды широко используются при работе с культурой клеток и тканей растительного происхождения, прежде всего в опытах по генетической трансформации [4].

Избирательность действия аминогликозидов на бактериальную клетку обеспечивается существенным различием рибосом у бактерий и эукариот. Однако существуют антибиотики, блокирующие синтез белка, реагирующие с рибосомами и микроорганизмов, и животной клетки. В медицинской практике они не используются, но производятся как реагенты для биохимических и молекулярно–биологических исследований (например, антибиотик циклогексимид) [5].

Цель работы: изучить влияние аминогликозидных антибиотиков (гентамицина, стрептомицина, канамицина, амикацина) и цитокинина 6-БАП на патологию митоза в Allium- тесте.

Методика исследований

Исследование ответных реакций растений лука обыкновенного в условиях действия водных растворов антибиотиков выполняли с помощью Allium -теста [6] на сорте «Стурон». В качестве контроля использовали очищенную водопроводную воду.

Тестировали следующие антибиотики: амикацин (Синтез АКОМП, Россия) в концентрации 500,0 мг/л, гентамицин (гентамицина сульфат, РУП «Белмедпрепараты», Беларусь) — 50,0 и 100,0 мг/л; стрептомицин (стрептомицина сульфат; ЗАО «Брынцалов-А», Россия) — 150,0 и 1000,0 мг/л; канамицин (ЗАО «Брынцалов-А», Россия) — 100,0 и 1000,0 мг/л; и цитокинин 6-бензиламинопурин (6-БАП) (Sigma-Aldrich, USA) — 5,0 мг/л.

Давленые препараты для цитогенетического анализа, окрашенные ацетогематоксилином, изготавливали по общепринятой методике [7]. Просмотр препаратов

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 6. №3. 2020 DOI: 10.33619/2414-2948/52 осуществляли на компьютеризированной кариологической станции, оснащенной микроскопом Leica DMR при увеличении 40×10×1,5. Цитогенетический анализ выполняли по [7–8].

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета прикладного программного обеспечения Microsoft Excel и «Statsoft (USA) Statistica v.7.0. Для данных, подчиняющихся нормальному закону распределения, использовали t-критерий Стьюдента. Нулевую гипотезу отклоняли при уровне статистической значимости p<0,05 [9].

Результаты исследований

Результаты тестирования аминогликозидных антибиотиков показали возрастание в 1,3-3,0 раза значений патологии митоза (ПМ) в клетках образовательной ткани по сравнению с контролем в вариантах применения гентамицина и стрептомицина (Рисунок). В то же время действие канамицина подавляет патологические процессы в клетках, патология митоза снижается до 1,5 раз по сравнению с контролем. При использовании амикацина наблюдали нормальное значение уровня спонтанного мутирования: около 5% [10]. Причем, определение корреляционных отношений между ПМ с учетом профазы и ПМ без учета профазы выявило высокое положительное значение, равное 0,92.

При повышении концентрации гентамицина и канамицина наблюдали снижение уровня патологических процессов в клетках, о чем свидетельствует уменьшение значения ПМ с 21,7% до 16,7% у гентамицина и с 11,3% до 8,1% у канамицина. При возрастании концентрации стрептомицина установлено увеличение числа клеток с патологией митоза в 2,2 раза, и это было самое высокое значение ПМ, равное 35,3% (Рисунок 1).

Рисунок 1. Влияние тестируемых веществ на патологию митоза. Варианты опыта: 1 — контроль; 2 — 6-БАП, 5,0 мг/л; 3 — гентамицин, 50,0 мг/л; 4 — гентамицин, 100,0 мг/л; 5 — гентамицин, 100,0 мг/л + 6-БАП, 5,0 мг/л; 6 — стрептомицин, 150,0 мг/л; 7 — стрептомицин, 1000,0 мг/л; 8 — стрептомицин, 1000,0 мг/л + 6-БАП, 5,0 мг/л; 9 — амикацин, 500,0 мг/л; 10 — канамицин, 100,0 мг/л; 11 — канамицин, 1000,0 мг/л.

При одновременном применении гентамицина и 6-БАП (Рисунок 1) выявлен рост числа клеток с патологией митоза по сравнению с соответствующими вариантами, когда упомянутые вещества применялись по отдельности. Противоположный результат отмечали в случае совместного использования цитокинина и стрептомицина, когда число клеток с патологией митоза снижалось.

Изучение доли клеток на стадии профазы показало, что в варианте применения канамицина (в концентрации 100 мг/л) она возрастает с 28,4% до 34,4% (Рисунок 2), в остальных вариантах отмечены либо сопоставимые значения либо снижение показателя по сравнению с контролем.

120,0

• ■ профаза ■ метафаза ■ анафаза ■ телофаза

  0,0

  
  

  4  48,86

  100,0

  22,

  80,0

  40,0

  20,0

  60,0

  н^

  

  13,42 21

  
  

  ⁹  20,89

  ₂   16,07  _21,42   14,

  14,52 25,06           ^18,

  21,66

  

  19,54   ^16,85

  16,09   ^{14,73   14,49}

  19,62  ^27,07

  
  

  34,03

  _{392 8}          43,15

  
  
  
  
  

  _25,08  34,40  _26,24

  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

  10      11

  
  

варианты опыта

Рисунок 2. Влияние тестируемых веществ на фазный индекс. Варианты опыта: 1 — контроль; 2 — 6-БАП, 5,0 мг/л; 3 — гентамицин, 50,0 мг/л; 4 — гентамицин, 100,0 мг/л; 5 — гентамицин, 100,0 мг/л + 6-БАП, 5,0 мг/л; 6 — стрептомицин, 150,0 мг/л; 7 — стрептомицин, 1000,0 мг/л; 8 — стрептомицин, 1000,0 мг/л + 6-БАП, 5,0 мг/л; 9 — амикацин, 500,0 мг/л; 10 — канамицин, 100,0 мг/л; 11 — канамицин, 1000,0 мг/л.

Задержка митоза в профазе относится к группе митозов, связанных с повреждением хромосом. Часто наблюдается при нарушениях процессов редупликации хромосом, что обычно происходит при различных воздействиях, нарушающих синтез ДНК.

В то же время увеличилась доля клеток на стадии метафазы во всех опытных вариантах. Наиболее существенно по сравнению с контролем метафазный индекс возрос в 1,7 раза в варианте «стрептомицин, 1000 мг/л» (Рисунок 2). Полученные значения метафазного индекса в эксперименте свидетельствуют о том, что аминогликозидные антибиотики вызывают патологии митоза, связанные с повреждением митотического аппарата в большей или меньшей степени.

Доля клеток на стадии анафазы колебалась незначительно по отношению к контрольной цифре во всех вариантах опыта, кроме варианта «стрептомицин, 1000 мг/л», где данный показатель снизился в 1,4 раза (Рисунок 2).

Значение телофазного индекса в большинстве опытных вариантов сопоставимо с контрольной цифрой. Исключение составляют варианты «гентамицин, 100 мг/л» и «стрептомицин, 1000,0 мг/л», когда доля клеток на стадии телофазы увеличилась по сравнению с контролем в 1,6 раза (Рисунок 2).

Необходимо отметить, что наиболее существенные изменения при прохождении всех основных фаз митоза регистрировали только в варианте «стрептомицин, 1000 мг/л».

Применение гентамицина в концентрации 50,0 мг/л не оказывало влияние на фазные индексы, в то время как увеличение концентрации до 100,0 мг/л существенно повлияла на прохождение большинства регистрируемых фаз митоза. Аналогичная картина наблюдалась и при повышении концентрации стрептомицина. В то же время канамицин в концентрации 100,0 мг/л способствует повышению доли клеток на стадии профазы, а при концентрации 1000,0 мг/л содействует повышению доли клеток на стадии метафазы.

Если анализировать совместное действие 6-БАП и гентамицина, то следует отметить, что данная комбинация незначительно повлияла на прохождение отдельных фаз митоза по сравнению со значением в контроле. В то время как по отношению к вариантам применения этих веществ в отдельности отмечено повышение доли клеток в телофазе. При совместном применении 6-БАП и стрептомицина установлено снижение доли клеток в профазе, метафазе и увеличение доли клеток в анафазе и телофазе при сравнении с соответствующими вариантами опыта, когда тестируемые вещества применялись в монорастворе. В исследуемых вариантах совместного применения цитокинина и тестируемых аминогликозидных антибиотиков отмечено влияние 6-БАП на прохождение митоза. Необходимо упомянуть, что цитокинины стимулируют экспрессию специфического циклина и тем самым ускоряют переход от фазы G2 к делению [11–13]. Такое увеличение темпа прохождения клеточного цикла на начальной стадии митоза, по-видимому, оказывает влияние на распределение фазных индексов при использовании 6-БАП (рисунок 2).

Заключение

Таким образом, результаты тестирования аминогликозидных антибиотиков показали возрастание в 1,3-3,0 раза патологических митозов в клетках по сравнению с контролем в вариантах применения гентамицина и стрептомицина. В то же время действие канамицина и амикацина подавляют патологические процессы в клетках. При рассмотрении фазных индексов отмечено индуцирование тестируемыми аминогликозидными антибиотиками такой патологии митоза как задержка митоза в метафазе, что связано с повреждением митотического аппарата. Наиболее существенные изменения при прохождении всех основных фаз митоза регистрировали в варианте «стрептомицин, 1000 мг/л».