Влияние факторов роста тромбоцитов на пролиферацию сперматогенного эпителия после локального облучения электронами в нестерилизующей дозе

Демяшкин Григорий Александрович – к.м.н., заведующий отделом патоморфологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, ведущий научный сотрудник Института трансляционной медицины и биотехнологии ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) Минздрава России; ORCID:

Проблема мужского бесплодия затрагивает до 15% супружеских пар и связана с эндокринной, аутоимунной, инфекционной причинами или возникает идиопатически. При этом клинико-лабораторные проявления бесплодия (в первую очередь азооспермия) зависят от патоморфологических изменений сперматогенеза, к которым относятся снижение количества мужских половых клеток, подвижность сперматозоидов и др. [1, 2].

При изучении патогенетических механизмов мужского бесплодия применяют различные модели на лабораторных животных с последующей экстраполяцией результатов на человека. При моделировании, в качестве гонадотоксичных факторов используют лекарственные препараты из группы цитостатиков или ионизирующее излучение (β-, γ-, X-лучи и др.), приводящие к нарушению репликации ДНК и транскрипции РНК, подавляющему клеточный цикл мужских гамет [3].

В последнее время, активно проводят доклинические исследования различных препаратов и их аналогов, действие которых направлено на восстановление мужской репродуктивной функции [4, 5]. Одним из перспективных направлений можно считать использование бедной лейкоцитами плазмы, обогащенной тромбоцитами (LP-PRP), содержащей множество факторов роста (PDGF, TGF-β, VEGF, EGF и др.), которые участвуют в регуляции различных фаз жизненного цикла мужских половых клеток [6, 7]. Так, при ингибировании сперматогенеза цитостатиком на фоне введения PRP выявили увеличение количества сперматогенных стволовых клеток, подвижности сперматозоидов и уровня тестостерона [8]. В специализированной научной литературе данные об изучении влияния PRP на сперматогенез после облучения практически отсутствуют.

Размножение и гибель мужских половых клеток регулируются белками Ki-67, обеспечивающими пролиферацию, и каспазами, ответственными за апоптоз [9, 10].

Семенник обладает высокой чувствительностью к радиоактивному излучению, что проявляется снижением митотического деления и гибелью половых клеток, в особенности сперматогоний [11]. Активация апоптоза происходит по внешнему и внутреннему путям, а за терминальную фазу ответственна каспаза-3. Другими регуляторами клеточного цикла являются проапоптотический (р53) и антиапоптотический (Bcl-2) белки [9].

Дисбаланс между пролиферацией и апоптозом мужских половых клеток, в том числе вызванный облучением, сопровождающийся уменьшением клеточного пула, за счет модуляции GSK3-, ERK- и Ras/Raf/MEK-1 сигнальных путей, ведет к деактивации Bсl-2 и индукции p53 [12, 13].

Таким образом, в настоящее время снижение мужской репродуктивной функции, вызванное различными видами облучения и, в частности электронами, обусловленное повреждением различных стадий жизненного цикла гамет, остается актуальным. Не менее важной является разработка методов коррекции возникших патоморфологических изменений.

Цель исследования: иммуногистохимическая оценка пролиферации сперматогенного эпителия после облучения электронами дозой 2 Гр и коррекции плазмой, обогащенной тромбоцитами.

Для осуществления цели поставлены следующие задачи: изучение уровня экспрессии универсального фактора пролиферации ‒ Ki-67; маркеров антиапоптоза (Bcl-2) и проапоптоза (р53) в извитых семенных канальцах.

Материал и методы

Экспериментальное морфологическое исследование проводили на базах Медицинского радиологического научного центра имени А.Ф. Цыба и Сеченовского университета.

Животные для исследования in vivo. Крысы породы Wistar (n=135) были поделены на группы (условные названия): I – контрольная (n=10), которым вводили физиологический раствор; II, III, IV (n=95) – однократное локальное облучение семенников электронами дозой 2 Гр (2IR; мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля – Ø 100 мм, линейный акселератор «NOVAC-11»); животным III-ей группы (n=30) в течение 11 недель вводили плазму, содержащую высокую концентрацию тромбоцитов и низкую концентрацию лейкоцитов – LP-PRP в комбинации с рекомбинантным IGF-1, а IV-ой группе (n=30) только LP-PRP; самцы V-ой группы (n=30) получали LP-PRP. Животных всех групп постепенно выводили из эксперимента 1 раз в 2 недели на протяжении 12 недель.

Все манипуляции осуществляли согласно Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (ЕЭС, Страсбург, 1985), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ЕЭС, Страсбург, 1986), Руководствам по проведению медико-биологических исследований по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR, DELS), Правилам лабораторной практики и приказу Минздрава России № 199н от 01.04.2016 «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), протокол № 043 от 11.08.2020 г.

Семенники после фиксации в растворе Буэна для иммуногистохимического исследования приготавливали по стандартному протоколу. Демаскировку антигенов проводили в цитратном буфере, рН 6,0. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к Ki-67 (Clone MM1; 1:200), Bcl-2 (Clone bcl-2/100/D5; 1:50) и p53 (Clone DO-7; 1:200). Для определения вторичных антител использовались универсальная двухкомпонентная система детекции HiDef Detection™ HRP Polymer system, («Cell Marque», США), анти-IGG мыши/кролика, пероксидаза хрена (HRP) и субстрат DAB. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.

Подсчет количества иммунопозитивных клеток проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при увеличении × 400 (в процентах).

Микроскопический анализ выполнялся с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD).

Статистический анализ . Полученные данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Рассчитывали средние арифметические величины с предельными отклонениями и среднеквадратичную ошибку. Сравнение между группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA со значимостью P < 0,05 .

Результаты исследования

Гистологическое исследование. В контрольной группе – физиологический сперматогенез. В семенниках крыс II-ой, III-ей и IV-ой групп через неделю после облучения наблюдали нарушение гистоархитектоники и признаки гипосперматогенеза, которые сохранялись в группе облученных животных без PRP-коррекции до окончания эксперимента (Рис. 1). На фоне введения LP-PRP+IGF-1 и LP-PRP наблюдали постепенное увеличение количества половых клеток, начиная с 14 суток эксперимента: на 42 сутки сперматогоний – в 2,0 раза, сперматоцитов – в 4,0 раза и сперматид – в 3,0 раза в сравнении с самцами II-ой группы. К окончанию исследования количество половых клеток увеличивалось до значений, близких к показателям контрольной группы, а в просвете семенных канальцев присутствовали сперматозоиды (на 12 неделе) (Рис. 1). Животные V-ой группы после введения LP-PRP на протяжении эксперимента не показали достоверных отличий по всем изученным параметрам по сравнению с контрольной группой (Рис. 1).

Контроль

2IR (2 Гр)

2IR+PRP+IGF

2IR+PRP

PRP

Рис. 1. Морфологическая картина семенников крыс на 12 неделе эксперимента в группах контроля, облучения (2IR), облучение+PRP+IGF-1 (2IR+PRP+IGF-1), облучение+PRP (2IR+PRP) и PRP. Окраска – гематоксилином и эозином, увелич. ×200.

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование. При анализе распределения Ki-67 после облучения (II-ая группа) отмечали уменьшение экспрессии исследуемого маркера в 4,6 раз (16,3±1,1%, P < 0,05 ) к окончанию эксперимента по сравнению с контрольными значениями (76,0±1,4%, P < 0,05 ). На фоне введения PRP самцам III-ей и IV-ой групп отмечали постепенное увеличение Ki-67-позитивных половых клеток по сравнению со II-ой группой: к окончанию эксперимента оно было выше в 3,5 раза (в комбинации с IGF-1) и 2,8 раза – 56,7±1,2% и 46,4±1,2%, соответственно, при P < 0,05 . В V-ой группе достоверных различий по сравнению с контрольными образцами не было обнаружено (Табл. 1, Рис. 2).

Практически аналогичную иммуногистохимическую картину демонстрировал антиапоптотический белок Bcl-2: через неделю после облучения отмечали снижение позитивно окрашенных половых клеток в 1,8 раз (29,3±1,1%, P < 0,05 ) по сравнению с контрольной группой (53,4±1,2%, P < 0,05 ). После введения PRP в комбинации с IGF-1, начиная со 2-ой недели после облучения, обнаружили постепенное увеличение количества Bcl-2-позитивных половых клеток, которое к 12-ой неделе было в 3,7 раз больше (33,9±1,2%, P < 0,05 ), чем у самцов II-ой группы (9,1±1,1%, P < 0,05 ), а в семенных канальцах животных IV-ой группы – в 2,5 раза (23,5±1,2%, P < 0,05 ). Показатели Bcl-2 в семенниках V-ой группы были близки к контрольным значениям (Табл. 1, Рис. 2).

Количество р53-окрашенных половых клеток варьировало на разных стадиях эксперимента (Табл. 1). Так, через неделю после облучения электронами в дозе 2 Гр наблюдалось увеличение количества p53-позитивных гамет в 1,3 раз (57,1±1,1%, P < 0,05 ), преимущественно сперматогоний, по сравнению с контрольной группой (54,3±1,2%, P < 0,05 ), в которой преобладали p53-окрашенные сперматиды и сперматозоиды. После введения комбинации PRP и IGF-1 крысам III-ей группы и PRP животным IV-ой группы отмечали постепенное уменьшение доли позитивных половых клеток в 1,8 (40,3±1,1%, P < 0,05 ) и в 1,6 (44,1±1,1%, P < 0,05 ) раз, соответственно, к 12-ой неделе по сравнению со II-ой группой. В V-ой группе на всем протяжении эксперимента не было выявлено статистически значимых различий в количестве p53-позитивных гамет по сравнению с контрольной группой (Табл. 1, Рис. 2).

Таким образом, на основании полученных результатов иммуногистохимического исследования четко прослеживается увеличение пролиферативной активности половых клеток, особенно сперматогоний, после введения PRP в комбинации с IGF-1 с опережением на 2 недели по сравнению с группой, которой вводили только PRP.

Таблица 1. Доля ИГХ-позитивных клеток в извитых семенных канальцах контрольной и опытных групп, %

Группы	Ki-67 M±STD	Bcl-2 M±STD	p53 M±STD
Контроль	76,0±1,4	53,4±1,2	54,3±1,2
2IR 7 сутки	53,7±1,2a	29,3±1,1a	57,1±1,1a
2IR 14 сутки	34,2±1,3a	15,2±1,1a	65,4±1,1a
2IR 56 сутки	21,4±1,0a	12,5±1,1a	69,9±1,2a
2IR 84 сутки	16,3±1,1a	9,1±1,1a	74,8±1,2a
2IR+PRP+IGF 14 сутки	42,5±1,3b	23,7±1,1b	60,3±1,2b
2IR+PRP+IGF 56 сутки	47,1±1,2b	26,5±1,2b	51,6±1,1b
2IR+PRP+IGF 84 сутки	56,7±1,2b	33,9±1,2b	40,3±1,1b
2IR+PRP 14 сутки	39,4±1,1c	17,8±1,1c	62,9±1,2c
2IR+PRP 56 сутки	43,2±1,3c	20,3±1,1c	57,6±1,2c

2IR+PRP 84 сутки 46,4±1,2c 23,5±1,2c 44,1±1,1c PRP 73,6±1,4 48,8±1,3 51,3±1,2 aP < 0,05 (Контроль и 2IR), bP < 0,05 (2IR и 2IR+PRP+IGF-1), cP < 0,05 (2IR и 2IR+PRP); M – выборочное среднее, STD – выборочное стандартное отклонение

А

Б

В

Г

Ki-67

Bcl-2

p53

Д

Рис. 2. Семенные извитые канальцы на 12 неделе эксперимента. Иммуногистохимические реакции с антителами к Ki-67, Bcl-2, p53; доокрашивание ядер – гематоксилином, увелич. ×400. А – контроль; Б – после облучения электронами дозой 2 Гр (2IR); В – после облучения электронами дозой 2 Гр и введения плазмы, обогащенной тромбоцитами с инсулиноподобным фактором роста-1 (2IR+LP-PRP+IGF-1); Г – после облучения электронами дозой 2 Гр и введения плазмы, обогащенной тромбоцитами (2IR+LP-PRP); Д – после введения плазмы, обогащенной тромбоцитами (LP-PRP).

Обсуждение результатов

Данное исследование посвящено изучению нарушения пролиферации половых клеток, возникшего после воздействия ионизирующего излучения на сперматогенез, и модулируемое факторами роста плазмы, обогащенной тромбоцитами.

После локального облучения электронами дозой 2 Гр в экспериментальных группах наблюдали выраженное снижение количества Ki-67-позитивных половых клеток, которое связано с прямым токсическим действием β-излучения на активно пролиферирующие гаметы, прежде всего сперматогоний, в которых происходят повреждения и нарушения и повреждения клеточных мембран и структуры макромолекул (ДНК, РНК, белков, липидов и др.), MAPK-, PI3K-и NFκB-сигнальных путей, белков семейства ErbB и клеточного дыхания на уровне цепи переноса электронов в митохондриях, что приводит к дисбалансу антиоксидантной и прооксидантной систем [14]. Кроме того, обнаруженное угнетение дифференцировки половых клеток связано с повреждением таких сигнальных путей как PI3-киназы/Akt и Ras/Raf/MEK-1, а также гликоген синтазы киназы-3 (GSK-3) и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK) [12].

Модулирование активности вышеперечисленных каскадов также приводит к хромосомным мутациям, что подтверждено увеличением доли p53-позитивных половых клеток. Следует отметить, что после облучения наблюдали снижение количества митотически делящихся генераций, в то время как при нормальном сперматогенезе преимущественно уменьшается пул мейотически делящихся гамет вследствие их активной селекции при кроссинговере [15].

Индуцированное облучением электронами уменьшение количества Bcl-2-позитивных клеток связано с ингибированием трансляции мРНК Mcl-1 (белок, родственный Bcl-2) и его быстрым разрушением за счет протеасомной деградации, опосредованной фосфодегроном при участии GSK-3-сигнального пути, что приводит к смещению пролиферативно-апоптотического баланса в сторону апоптоза [13].

Известно, что действие ионизирующего излучения приводит к снижению экспрессии ключевых факторов роста, оказывающих прямое положительное влияние на пролиферацию и дифференцировку половых клеток. В связи с этим, было целесообразным применение плазмы, обогащенной тромбоцитами, α-гранулы которых содержат высокую концентрацию факторов роста, что, в итоге, приводит к усилению регенеративной активности гамет [16].

Входящие в состав PRP биологически-активные вещества, в первую очередь трансформирующий фактор роста-β, эпидермальный фактор роста и инсулиноподобный фактор роста-1, индуцируют митотическую активность неповрежденных сперматогониальных стволовых клеток и, тем самым, восстанавливают пролиферативно-апоптотический баланс [17].

Для усиления положительных эффектов PRP был выбран рекомбинантный IGF-1, который, проходя через гематотестикулярный барьер и плазмолемму половых клеток, стимулировал их пролиферацию, дифференцировку и регенеративную активность, что было подтверждено увеличением Ki-67- и Bcl-2-позитивных клеток в III-ей группе.

Заключение

Факторы роста α-гранул активированных тромбоцитов PRP, являющиеся ключевыми регуляторами жизненного цикла половых клеток, после облучения стимулируют восстановление пролиферативно-апоптотического баланса, усиленное дополнительным введением IGF-1 и подтвержденное на уровне экспрессии Ki-67, Bcl-2 и p53.