Влияние генетического полиморфизма на тератозооспермию и кариопатологические изменения десквамированных эпителиоцитов урогенитального тракта при инфертильности у вахтовых рабочих нефтегазопромыслов Севера Сибири

экспериментальная и клиническая урология № 3 2 0 16

орфологические изменения сперматозодов являются результатом сложных внутриклеточных процессов во время сперматогенеза, когда из диплоидной клетки в результате последовательных делений образуются гаплоидные сперматиды и после трансформации ядра и органоидов, формируется зрелый сперматозоид [1]. Регистрируемый уровень аномальных сперматозоидов может служить индикатором наличия дефектного механизма, связанного с процессом созревания сперматозоидов [2]. Кроме того, морфология сперматозоидов является классической характеристикой параметров качества спермы, а ее изменения служат маркером генетических повреждений молекулярных структур ядер клеток организма [2,3]. Известно что, около 15% супружеских пар страдает бесплодием, причем треть случаев обусловлена мужским бесплодием [4]. Имеются многочисленные исследования, посвященные патологическим изменениям сперматозоидов в связи с мужским беспло- дием. Приводятся самые разнообразные причины образования патологических изменений сперматозоидов: фрагментация ДНК, оксида-тивный стресс, апоптоз, что по мнению некоторых ученых, в основном связано с загрязнением условий окружающей среды факторами мутагенной природы [1,5]. Ранее нами было установлено, что у вахтовых рабочих-нефтяников на севере Сибири значимо возрастает число соматических клеток буккального и урогенитального эпителия, лимфоцитов крови с цитогенетическими нарушениями, что мы склонны были считать следствием влияния на рабочего-нефтяника углеводородов с генотоксическими эффектами [6]. Закономерно возникает предположение, что генеративные клетки у рабочего-нефтяника так же подвержены генотоксическим воздействиям. Наши исследования показали, что цитогенетические изменения в соматических клетках у рабочих-нефтяников зависят от присутствия в их генотипе мутационных аллелей генов глутатион-S-трансферазы – GSTM1 и GSTT1 [7]. A.C. Finotti и соавт. установили, что при наличии в генотипе мутантных «нулевых» аллелей генов GSTM1 и GSTT1 у мужчин повышено число патологически измененных сперматозоидов [8]. Кроме того, имеются исследования, доказывающие роль цитогенетических нарушений в патологических изменениях сперматозоидов и бесплодии пациента, однако это заключение поддерживается далеко не всеми учеными [9,10].

Целью данной работы было изучение зависимостей между частотой различных форм тератозоо-спермии и кариопатологически измененных эпителиоцитов урогенитального тракта и носительством мутантных вариантов генов фермента глутатион-S-трансферазы (GSTM1 и GSTT1) у вахтовых рабочих-нефтяников, страдающих ин-фертильностью.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследовано 170 рабочих-нефтяников мужского пола в возрасте от 28 до 39 лет, впервые обратившихся к врачу-андрологу по поводу отсутствия потомства при состоянии в браке без применения конт- экспериментальная и клиническая урология №3 201 6 рацепции на протяжении нескольких лет и отсутствии у супруги, согласно медицинскому заключению, каких либо изменений, препятствующих зачатию. Для анализа у всех обследуемых были взяты образцы спермы и эпителий урогенитального тракта. Все обследованные дали документированное согласие на проведение настоящего исследования. Одновременно нами проведено анкетирование, позволяющее составить представление о факторах риска в жизнедеятельности обследуемого донора. У каждого человека анализировали не менее 1000 эпителиоцитов и сперматозоидов. Для морфологически нормального сперматозоида характерна овальная форма головки, длина ее составляет 5-6 мкм, ширина – 2,5-3,5 мкм, акро-сомальный участок занимает от 40 до 70% площади головки, при этом отсутствуют аномалии шейки, хвоста и срединного отдела. Отмечались выраженные изменения размеров головки, что подтверждалось путем измерения окуляр-микромет-ром. Изменения формы, дефекты акросомальной области, удвоение головки, а также аномалии шейки и хвоста оценивались визуально в соответствии с методическими указаниями ВОЗ и строгими критериями Крюгера [11,12].

Среди генов, задействованных в системе детоксикации, были изучены два полиморфных варианта генов GSTM1 и GSTT1, относительно которых имеются исследования, подтверждающие их протективную роль в отношении индукции ксенобиотиками хромосомных аномалий [13]. При анализе генов GSTM1 и GSTT1 на наличие делеций использовали мультиплексную ПЦР. В ам-плификационную пробу вносили две пары праймеров, что давало возможность одновременно ампли-фицировать фрагменты каждого из указанных генов. Разделение продуктов амплификации генов GSTM1 и GSTT1 проводили в горизонтальном 3% агарозном геле, приготовленном на однократном трис-борат- ном буфере с добавлением бромистого этидия и визуализацией в проходящем УФ-свете. Напряженность электрического поля при разделении фрагментов ДНК составляла 1-8 В/см2.

Нормальные аллели генов характеризуются присутствием ПЦР-продуктов: для GSTM1 – гомозиготы GSTM1(+/+) и гетерозиготы GSTM1(+/0); для GSTT1 – гомозиготы GSTT1(+/+) и гетерозиготы GSTT1(+/0). Делеционные («нулевые») гомозиготные варианты – GSTM1 (0/0) и GSTT1 (0/0) выявлялись по отсутствию фрагментов генов GSTM1 и GSTT1. Для генов GSTM1 и GSTT1 генотип 0/0 означает отсутствие на электрофореграмме фрагмента, соответственно, и данный индивидуум гомозиготен по делеции. Знак «+» означает присутствие фрагмента и данный донор либо гетерозиготен, либо гомозиготен по отсутствию делеции в указанных генах.

Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ STATISTI-CA v.6.0. Частоты гаплотипов сцепленных локусов для гена GSTM1, рассчитывали в программе “The EH

Таблица 1. Частота эпителиоцитов урогенитального тракта с кариопатологическими изменениями и показатели тератозооспермии у рабочих-нефтяников, страдающих инфертильностью, в связи с полиморфизмом мутантных «нулевых» аллелей генов GSTM1 и GSTT1 , в сравнении с нормальным контролем – GSTM1 (+)/ GSTT1 (+)

		Генотипы
Типы патологических		GSTM1 (0/0) GSTT1 (0/0)	GSTM1 (+) GSTT1 (0/0)	GSTM1 (0/0) GSTT1 (+)	GSTM1 (+) GSTT1 (+)
изменений клеток		n=62	n=44	n=38	n=26
		Показатели кариопатологических изменений в эпителиоцитах (в ‰)
Аберрантные клетки всех типов		38,0 ± 4,2***	11,8 ± 1,6	22,9 ± 2,7**	9,0 ± 1,4
Микроядра		11,2 ± 1,4***	4,8 ± 0,5	7,9 ± 0,5**	4,3 ± 0,3
Центральная круговая насечка		5,8 ± 0,4**	2,9 ± 0,6	4,3 ± 0,6*	2,1 ± 0,4
Протрузии типа «разбитое яйцо»		4,9 ± 0,6***	0,4 ± 0,5	1,8 ± 0,4*	0,5 ± 0,2
Протрузии типа «язык»		2,2 ± 0,3**	0,8 ± 0,3	1,7± 0,2**	0,4 ± 0,2
Двуядерные клетки		3,8 ± 0,7**	0,4 ± 0,2	1,3 ± 0,4*	0,2 ± 0,1
Кариорексис		2,4±0,6***	0,1 ± 0,1	1,2 ± 0,3**	0,1 ± 0,1
Кариолизис		2,1 ± 0,4**	0,5±0,3	0,4 ± 0,1	0,3 ± 0,2
Кариопикноз		0,8 ± 0,2	0,6 ± 0,2	0,4 ± 0,2	0,3 ± 0,1
Перинуклеарные вакуоли		4,8 ± 0,7**	1,3 ± 0,9	3,9 ± 0,6**	0,8±0,4
Дефекты головки сперматозоида	Показатели тератозооспермии (в ‰ )
	размера	144,8±13,6*	36,9±6,8	66,7±7,9***	28,6±3,6
	формы	87,9±7,8***	22,6±5,5	34,8±6,2**	17,2±2,2
	акросомальной области	112,6±11,8*	23,4±6,7	52,0±6,9***	21,4±3,6
	числа головок	57,5±6,2***	14±3,4	34,8±4,1***	12,6±2,9
Дефекты шейки		81,3±6,7***	39,2±6,5	81,6±5,8***	36,9±5,7
Дефекты хвоста		42,7±5,5	42,4±5,6	43±4,9	32,4±4,8

Примечание. Значимые различия показателей между когортами обследуемых рабочих, имеющих в генотипе нулевые аллели генов GSTM1 (0/0) и GSTT1 (0/0), и группой рабочих с нормальным генотипом GSTM1 (+)/ GSTT1 (+) отмечены звездочками: * – при p <0,05; ** – при p <0,01; *** – при p <0,001

software program, Rockefeller University, NY”. Все количественные показатели исследования обрабатывали с применением корреляционного анализа по Спирмену и t-критерия Стьюдента для независимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова не выявило отличий от нормального. Анализ статистических различий качественных признаков производили с использованием теста χ2 с поправкой Йейтса на непрерывность [14]. Различия сравниваемых результатов (X±m, где X – выборочное среднее арифметическое, m – ошибка среднего арифметического) считались достоверными при достигнутом уровне значимости p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что наблюдается четко выраженный полиморфизм в уровне кариопатологических изменений в эпителиоцитах урогенитального тракта у рабочих-нефтяников с инфертильностью в зависимости от их генотипа (табл. 1). и экспериментальная и клиническая урология №3 20 1 6

Особенно существенно повышенным был уровень кариопатологиче-ских нарушений у рабочих, имеющих сочетание гомозиготного нулевого генотипа одновременно по генам GSTM1 и GSTT1. Значимое повышенное число клеток с карио-патологическими изменениями было также зарегистрировано и для рабочих с инфертильностью, имеющих сочетание генов GSTM1 (0/0) и GSTT1 (+), по сравнению с нормальными гомозиготами – GSTM1(+)/ GSTT1(+) и гетерозиготами GSTM1(+)/ GSTT1(0/0). Среди наблюдаемых аберраций наиболее часто наблюдались клетки с микроядрами и протрузиями, которые можно отнести к истинным цитогенетическим аберрациям, поскольку они образуются в результате образования ацентрических фрагментов хромосом и отставания в митозе отдельных целых хромосом [13]. Частота клеток с микроядрами у рабочих с инфертильностью, имеющих нулевой гомозиготный генотип по генам GSTM1 и GSTT1, превышала контрольный уровень в 2,6 раза (11,2± 1,4‰ при 4,3±0,3‰ в контроле; p<0,001), протрузии типа «разбитое яйцо» – в 9,8 раза (4,9±0,1‰ и 0,5±

Таблица 2. Коэффициенты корреляции между показателями кариопатологических изменений в эпителиоцитах урогенитального тракта и тератозооспермии в семенной жидкости у рабочих с инфертильностью, гомозиготных по нулевым аллелям генов глутатион-S-трансферазы – GSTM1 (0/0)/ GSTT1 (0/0)

Аномальные формы	Аномальные формы сперматозоидов
	Головка сперматозоида с дефектом				Дефекты	Дефекты
эпителиоцитов	размера	формы	акросомы	число головок	шейки	хвоста
Аберрантные клетки всех типов	+0,28	-0,17	+0,34	+0,12	-0,18	-0,21
Микроядра	+0,59*	+0,42	+0,07	+0,19	+0,45	+0,34
Центральная круговая насечка	+0,42	+0,53*	+0,22	+0,56	+0,34	-0,18
Протрузии типа «разбитое яйцо»	-0,21	+0,58*	+0,39	+0,28	-0,08	+0,14
Протрузии типа «язык»	+0,12	+0,74**	-0,21	-0,18	+0,12	+0,42
Двуядерные клетки	-0,18	+0,07	+0,34	+0,89***	+0,22	+0,12
Кариорексис	-0,17	+0,56*	-0,18	+0,28	-0,36	-0,21
Кариолизис	+0,12	-0,45	+0,37	+0,31	+0,42	-0,38
Кариопикноз	+0,61**	+0,28	-0,37	-0,21	+0,42	+0,45
Перинуклеарные вакуоли	+0,42	+0,79**	+0,41	+0,38	+0,16	-0,18

Примечание. Значимые различия показателей коэффициента корреляции отмечены звездочками: * – при p <0,05; ** – при p <0,01; *** – при p <0,001

0,2‰; p<0,05) и типа «язык» – в 5,5 раза (2,2±0,3‰ и 0,4±0,2‰; p<0,01). Ранняя деструкция ядра цитологически начинается как перинуклеарная вакуоль [18], не исключено, что такой показатель как центральная круговая насечка также свидетельствует о разрушении ядерной оболочки. В контроле этот показатель составил 2,1±0,4‰, а у рабочих с генотипом GSTM1(0/0)/GSTT1(0/0) – 5,8±0,4‰ (p<0,05). Апоптотический процесс распада хроматина ядра может выглядеть как кариолизис. Кариорексис это заключительный этап гибели клетки, часто образующийся при формировании многогруппового аномального митоза [6]. У рабочих с инфертильностью, имеющих нулевые гомозиготы по генам GSTM1 и GSTT1, число клеток с перинуклеарной вакуолью было значимо выше, чем в контрольной группе (p<0,001). То же самое можно сказать и о частоте клеток с карио-рексисом (p<0,001) и кариолизисом (p<0,01). Возрастание числа клеток с кариопикнозом у рабочих с ин-фертильностью, имеющих гомозиготный нулевой генотип по гену GSTM1(0/0), может, по-видимому, свидетельствовать об уменьшении гетерохроматизации в экспрессируемых участках генома эпителиоцитов [15].

В научной литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что нулевые генотипы по глутати-он-S-трансферазе (GSTM1 и GSTT1) ассоциированы с более высоким уровнем цитогенетических аберраций [16]. Полученные нами данные подтверждают это заключение в отношении гомозиготного нулевого генотипа GSTM1(0/0). В настоящем исследовании мы не обнаружили по изучаемым показателям различий между рабочими, имеющими гомозиготный нулевой генотип GSTM1(0/0)/GSTT1(0/0) и GSTM1(0/0)/GSTT1(+), что можно объяснить более значительным влиянием на кариопатологические последствия гена GSTM1(0/0), чем GSTT1 (0/0).

Анализ морфологических изменений сперматозоидов свидетельствует о том, что у рабочих с ин-фертильностью наблюдается значительное возрастание в семенной жидкости числа сперматозоидов с дефектами головки. У рабочих GSTM1(0/0), по сравнению с контролем, во много раз возрастало число сперматозоидов с изменением размеров и формы головки, а также с аномалиями акросомальной области, двойной головкой и дефектами шейки, при этом значимого увеличения частоты сперматозоидов с дефектами в области хвоста не отмечено (табл. 1).

Корреляционный анализ по результатам обследования рабочих с ин-фертильностью, являющихся носителями двойного гомозиготного нулевого генотипа GSTM1(0/0)/GSTT1(0/0), показал достоверную положительную связь между числом эпителиоцитов с микроядрами, а также пикнозом ядра с одной стороны и изменением размеров сперматозоидов с другой (в обоих случаях p<0,01) (табл. 2). При этом у рабочих отмечены случаи глобозооспер-мии, когда головка сперматозоида не имеет акросомы и она исключи- экспериментальная и клиническая урология №3 20 16 тельно маленьких размеров. Мы склонны считать, что одновременное отставание нескольких хромосом при делении клетки может приводить к появлению крупных микроядер и формированию сперматозоидов с маленькой головкой. Кластогенные процессы в клетках рабочих нефтепромыслов, сопровождающиеся аномальным расхождением нескольких хромосом показаны нами ранее [17]. Центральная круговая насечка ядерной оболочки имела значимые корреляционные зависимости от нескольких показателей аномалий сперматозоидов, включая дефект формы (p<0,05) и увеличение числа головок (p<0,01). Ядра с круговой насечкой, по мнению некоторых ученых, формируются в результате аномального строения ахроматинового веретена деления клетки, при этом не образуется перегородка между дочерними ядрами и дефектно проходит карио-томия [18]. Образование двуядерных эпителиоцитов имелo значимые корреляционные зависимости от увеличения показателя сператозои-дов, имеющих две головки (p<0,01). По-видимому, об этом же свидетельствует рост числа полиплоидных клеток у рабочих нефтепромыслов, что показано нами ранее [17]. Появление протрузий имело достоверную связь с изменением формы сперматозоидов. Возможно, это явление связано с изменением прочности и эластичности ядерной оболочки, что, по-видимому, может отражаться на формировании формы головки при сперматогенезе. Наблюдается также достоверная корреляционная связь между формой головки и такими показателями как кариорексис (p<0,01) и наличием в ядре перинуклеарных вакуо- лей (p<0,001). Не исключено, что сопряженные изменения в эпителии урогенитального тракта и тератозо-оспермия обусловлены наличием эндогенных генотоксикантов. Известно, что сперматозоиды спонтанно производят разнообразные активные формы кислорода, включая супероксид аниона, перекись водорода и окись азота и эта активность частично контролируется ферментной системой глютатион-S-трансферазы что, в свою очередь, может, по-видимому, способствовать кариопатологическим изменениям эпителиоцитов в урогенитальном тракте человека, особенно в случае носительства гомозиготного нулевого генотипа GSTM1 (0/0) [1].

Известно, что курение может приводить к повышению числа клеток с цитогенетическими нарушениями в организме человека-носителя мутантных («нулевых») аллелей фермента глутатион-S-трансфе-разы [16]. Анкетные данные по этому вопросу свидетельствуют, что число курящих во всех когортах рабочих было практически одинаковым (28,9-31,2%). Существенного повышения числа кариопатологиче-ских изменений и показателей тера-тозооспермии у курящих нами не наблюдалось. Несомненно, что в экстремальных условиях нефтедобычи на севере Западной Сибири имеется множество мощных факторов, которые могут оказывать не только мутагенное, но и ко-мута-генное действие. Помимо антропогенных факторов, это и природные факторы: низкие температуры, мощные геомагнитные поля авроральной зоны, геомагнитные аномалии, особенности светового режима (полярные ночь и день) и дефицит некоторых жизненно важных микроэлементов [17].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что у рабочих нефтяников с инфертильностью наблюдаются статистически значимые изменения частоты кариопато-логических нарушений эпителиоцитов урогенитального тракта и показателей тератозооспермии, в зависимости от генетического полиморфизма генов системы детоксикации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1, который выражается в наличии (или отсутствии) в генотипе мутантных «нулевых» аллелей этих генов. Показано, что у лиц, гомозиготных по «нулевому» аллелю гена GSTM1(0/0) значимо повышено число эпителиоцитов урогенитального тракта с микроядрами, протрузиями, насечками ядра, перинуклеарными вакуолями, кариолизисом и кариорексисом, а также уровни показателей, характеризующих те-ратозооспермию, по сравнению с рабочими-нефтяниками, которые имеют нормальный генотип – GSTM1(+)/GSTT1(+). При наличии гомозиготных «нулевых» аллелей генов GSTT1(0/0) такой закономерности не отмечено. Статистический анализ позволяет заключить, что имеется значимая связь между некоторыми формами кариопатологи-ческих изменений эпителиоцитов и показателями различных типов те-ратозооспермии, что может свидетельствовать в пользу вывода о корреляционной зависимости между наблюдаемыми изменениями в соматических и генеративных клетках у рабочих нефтепромыслов севера Западной Сибири.

экспериментальная и клиническая урология № 3 20 16

Резюме:

Цель настоящей работы заключалась в изучении связи кариопатологических изменений соматических клеток и те-ратозооспермии с полиморфизмом генов фермента глута-тион-S-трансферазы – GSTM1 и GSTT1 у рабочих-нефтяников с инфертильностью.

Материалы и методы. Обследовано 170 рабочих-нефтяников мужского пола с инфертильностью.

Результаты. Показано, что у рабочих с инфертильностью с гомозиготным «нулевым» генотипом GSTM1(0/0), значимо повышено число эпителиоцитов урогенитального тракта с микроядрами, протрузиями, насечками ядра, перинуклеарными вакуолями, кариолизисом и кариорексисом, а также существенно возрастают показатели, характеризующие тера-тозооспермию, по сравнению с рабочими-нефтяниками, которые имеют в генотипе нормальные аллели – GSTM1(+) или/и GSTT1(+). При наличии гомозиготного «нулевого» генотипа GSTT1(0/0) такой закономерности не отмечено.

Заключение. Корреляционный анализ позволяет заключить, что имеется значимая связь между некоторыми формами кариопатологических изменений эпителиоцитов и показателями различных типов тератозооспермии, что может свидетельствовать в пользу вывода о связи наблюдаемых изменений.