Влияние Helicobacter pylori на содержание провоспалительных Т-клеточных цитокинов и продуцирующих их субпопуляций

Вследствие этого оценка провоспалительного действия H. pylori и механизмов, определяющих склонность возбудителя как к регуляторному, так и провоспалительному действию представляется актуальной научно-практической задачей. Кроме того, значительный интерес представляет предварительно показанная для H. pylori возможность напрямую, без участия антигенпрезентирующих клеток (АПК) влиять по крайней мере на некоторые субпопуляции Т-клеток человека.

Целью работы была оценка способности H. pylori стимулировать образование INF-γ, IL-17A и Th17 в условиях прямого контакта между бактериями и Т-клетками, без участия АПК.

37 °С, в течение 7 суток. Идентификацию H. pylori осуществляли на основании культуральных и морфологических признаков.

Для оценки влияния H. pylori на дифференцировку лимфоцитов производилось сокультивирова-ние лимфоцитов с различными концентрациями бактерий (последовательно использовались соотношения лимфоцитов к H. pylori 1:10, 1:20, 1:50) в течение 18 часов в условиях: 5 % CO 2 , 37 °С, среда RPMI-1640 (Gibco, США) с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и 0,3 г/л L-глутамина («Панэко», Россия). Часть лимфоцитов со-культивировалась с бактериями в присутствии дополнительных стимуляторов – моноклональных антител к молекуле CD3 (1 мкг/мл, eBioscience, США), имитирующих воздействие на Т-клеточный рецептор, или смеси антител к CD3 и CD28 (1 мкг/мл, eBioscience, США, и 3 мкг/мл, Beckman Coulter, Франция), имитирующих воздействие АПК на Т-клетки. Имелись следующие культуры: лимфоциты с добавлением H. pylori , но без добавления стимулирующих антител; лимфоциты с добавлением антител к CD3 и без добавления бактерий; лимфоциты с добавлением антител к CD3 и с добавлением H. pylori ; лимфоциты с добавлением антител к CD3 и CD28, и без добавления H. pylori ; и лимфоциты с добавлением антител к CD3 и CD28 и добавлением H. pylori . Последний вариант добавлялся с целью оценить степень влияния, оказываемого на характер стимуляции непосредственным присутствием возбудителя. Эксперименты для всех соотношений лимфоцитов и бактерий проводились отдельно. Негативными контролями для всех вариантов культур служили лимфоциты без добавления H. pylori и стимулирующих антител.

По истечении 18 часов в культурах цитофлюорометрически оценивалось содержание Th17 как клеток фенотипа CD4+CD161+ и CD4+IL-17A+. Для окрашивания указанных маркеров применялись антитела к CD4, меченные FITC, антитела к CD161, меченные PE, антитела к IL-17A, меченные PE, все – производства eBioscience, США. Пермеабилизацию мембран, необходимую для мечения IL-17A, производили набором реагентов Fix/Perm Concentrate и Perm Buffer (eBioscience, США), согласно инструкциям производителя. Анализ осуществляли на ци-тофлюориметре FacsCalibur (Beckton Dickinson, США). Активность Th1 определялась путем измерения концентрации INF-γ в надосадках культур методом ИФА («Вектор-Бест», Россия). Для статистической обработки данных использовался критерий Ньюмена–Кейлса.

Результаты и их обсуждение. Одним из важных моментов в реализации иммунного ответа является повышение уровня INF-γ. Как активатор макрофагов этот цитокин задействован в непосредственном ответе на инфекционные атаки, кроме того, он усиливает эффекты интерферонов α и β, способствует развитию иммунного ответа по Th1-типу и обладает способностью стимулировать активность антигенпрезентирующих клеток [22]. Как можно видеть на рис. 1, добавление H. pylori к суспензии выделенных лимфоцитов как без дополнительных стимуляторов, так и в совокупности с антителами к CD3 или CD3/CD28 приводило к статистически достоверному повышению продукции INF-γ.

Рис. 1. Влияние H. pylory на продукцию INF-γ. Варианты стимуляции обозначены под диаграммой. Контроль – лимфоциты без добавления бактерий и антител, * – достоверные отличия от контроля ( p <0,05)

Данные о влиянии H. pylori на дифференцировку лимфоцитов в сторону Th17 и приобретении ими фенотипа CD4⁺CD161⁺ при отсутствии в культурах дендритных клеток представлены на рис. 2 и 3.

Как можно видеть, совместное культивирование H. pylori и Т-клеток в течение 18 часов не приводило к повышению числа CD4⁺CD161⁺-клеток. Среднее содержание их в культурах без стимуляции бактериями составляло 20,065 ± 0,72 % от всех CD4⁺-клеток, при добавлении H. pylori к отвечающим лимфоцитам в соотношении 10:1 составляло 22,15 ± 1,49 %. При этом содержание этих клеток

Рис. 2. Содержание CD4⁺CD161⁺-клеток в культуре Т-лимфоцитов при прямом сокультивировании с H. pylori без дополнительной стимуляции, в % от общего количества CD4+ клеток (данные репрезентативного эксперимента): а – контрольная суспензия лимфоцитов без добавления H. pylori , б – сокультивирование с H. pylori в соотношении 1:10, в , г – сокультивирование с H. pylori в соотношении 1:20 и 1:50 соответственно. Процентное содержание клеток указано в углах квадрантов

Рис. 3. Влияние H. pylory на содержание CD4⁺CD161⁺-клеток. Варианты стимуляции обозначены под диаграммой. Контроль – лимфоциты без добавления бактерий и антител

Содержание IL-17А⁺СD4⁺ клеток в условиях сокультивирования с H. pylory и/или дополнительной стимуляции антителами к CD3 и CD28

в культурах с соотношением клеток 1:20 и 1:50 также было практически не отличимо от контрольных значений нестимулированных лимфоцитов (для соотношения 20:1 содержание составило 24,2 ± 3,41 %, а для соотношения 50:1 – 23,15 ± 2,73 %.).

Для проверки значимости костимуляции нами были поставлены дополнительные эксперименты с добавлением стимулирующих антител к молекулам CD3 и CD3+CD28, предоставляющих Т-клеткам сигнал, подобный стимуляции от антигенпрезентирующих клеток. В культуре Т-лимфоцитов без H. pylori но с добавлением антител к CD3 содержание CD4⁺CD161⁺-клеток составило 23,745 ± 7,3 %. В то же время при добавлении и H. pylori, и антител к CD3 содержание CD4⁺CD161⁺-клеток составило 23,83 ± 3,30 % для соотношения 1:10, 25,4 ± 2,42 % для соотношения 1:20 и 25,4 ± 1,75 % для соотношения 1:50.

Молекула CD161 при ее коэкспрессии с молекулой CD4 широко используются в мировой научной практике как маркер популяции Th17. Однако наличие мембранных фенотипических маркеров не гарантирует функциональной способности отвечающих клеток к продукции IL-17A – основной функции Th17. Также, по мнению некоторых авторов, оценка содержания Th17 по наличию внутриклеточного IL-17A или его продукции является более надежным методом, чем применение CD161. Учитывая вышеизложенное, было оценено содержание внутриклеточного IL-17А в культурах лимфоцитов, отвечающих на H. pylory . Для этого произвели пермеабилизацию мембран отвечающих клеток и окрашивание их моноклональными антителами к IL-17A. Было установлено, что в применяющихся условиях культивирования большинство клеток не повышают экспрессию IL-17А (таблица).

Так, ни в одном из применяемых вариантов стимуляции и соотношений отвечающих клеток и бактерий содержание IL-17А+-клеток не превышало 0,5 % от всех CD4+-клеток пробы, что не отличается от нормального содержания IL-17+-клеток в крови человека [23–25].

Выводы. Прямое сокультивирование выделенных Т-лимфоцитов с H. pylori способствует резкому повышению продукции INF-γ, что в условиях данного эксперимента может с большой вероятностью свидетельствовать об активации Th1. Однако процент содержания Тh17, определяемых и как CD4⁺CD161⁺, и как CD4⁺IL17A⁺ в таких условиях сколько-нибудь значимо не изменяется. Можно предположить, что ответная реакция Т-хелперов на прямой контакт с H. pylori при ее провоспалитель-ном течении проходит по Th1-типу, без существенного вовлечения Th17. Механизм же, определяющий способность H. pylori стимулировать активность как Th1, так и T-reg (что было показано нами ранее), требует дополнительного исследования. В целом механизмы и действующие агенты, с помощью которых может осуществляться прямое воздействие патогенов на выбор преобладающего типа иммунного ответа, по мнению авторов, представляют значительный фундаментальный и практический интерес, поскольку потенциально могут быть использованы при разработке лекарственных средств, направляющих иммунный ответ в благоприятную сторону. Также значимы они и для оценки риска развития гиперстимулированных форм иммунного ответа у пациентов, инфицированных H. pylori .

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.