Влияние хронического психосоциального стресса на интенсивность дегенеративных изменений в сетчатке у крыс с различной стресс-резистентностью

С постоянным ростом требований, предъявляемых социальной средой, все более значимым становится влияние стрессовых факторов на нервную систему и организм в целом. Показано, что психогенный стресс приводит к росту заболеваемости многими психосоматическими патологиями [2, 7]. Эмоциональный стресс является важным фактором снижения качества жизни и трудоспособности населения. В то же время клинические наблюдения свидетельствуют о существовании как людей, так и животных с различной пред-расположенностью к развитию нарушений в сходных стрессогенных ситуациях [5].

В настоящее время значимая роль в реализации стрессовых влияний на клеточном уровне отводится производным сфинголипидов: сфингозину, церамиду и др., которые считаются одними из ключевых сигнальных молекул [8]. Сфинголипиды широко изучаются в качестве внутри- и межклеточных регуляторов при различных видах клеточного стресса. Так, церамид, как вторичный мессенджер, вызывает остановку

роста и программированную гибель клеток. Показано участие церамида во всех известных механизмах инициации апоптоза [7]. Ранее нами было показано, что накопление церамида в различных тканях при стрессорных воздействиях существенно выше у животных с низкой устойчивостью к стрессу по сравнению с резистентными особями [1]. Апоптоз ганглиозных клеток сетчатки считается одним из ключевых звеньев развития глаукомной оптической нейропатии [6].

Цель исследования: оценить влияние психосоциального стресса на интенсивность дегенеративных изменений в сетчатке под действием эмоционального стресса.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования проведены на 30 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г. с соблюдением всех регламентированных норм и правил этического обращения с лабораторными животными. Интенсивность дегенеративных изменений в сетчатке под действием эмоционального стресса оценивали гистологическими и иммуногистихимическими методами, также определяли содержание проапоптотического фактора церамида и его предшественника сфингомиелина в тканях заднего сегмента глаза и плазмы крови крыс методом тонкослойной хроматографии.

Для моделирования стресса 2-х месячных крыс на 2 месяца помещали в изолированные клетки при естественном световом режиме и свободном доступе к воде и пище. Перед помещением в условия изоляции, а также после нее животных тестировали согласно методу «открытого поля». По результатам тестирования были выделены 2 группы: стресс-устойчивые и стресс-неустойчивые (СУ и СН) крысы. После окончания периода изоляции животных ссаживали попарно с ежедневной сменой партнера. Проведено 2 серии опытов, в которых крысы подвергались воздействию 10-дневного (10 крыс) и 18-дневного (10 крыс) психосоциального стресса. 10 животных были интактными и послужили контролем. После окончания воздействий крыс выводили из эксперимента путем декапитации под тиопенталовым наркозом, глазные яблоки энуклеировали. Для гистологического и иммуногистохимического исследования глаза животных фиксировали в 10% нейтральном формалине 24 часа и использовали для приготовления парафиновых срезов согласно стандартному протоколу (Sennlaub F. et al., 2002). Срезы толщиной 5 мкм приклеивали на стекла с адгезивным покрытием (Silane-Prep Slides, Sigma). После депарафинирования для иммуногистохимического исследования срезы обрабатывали методом TUNEL (Terminal desoxynucleotidyl transferase – mediated desoxyuridine triphosphate (UTP) – nick end labeling). Использовали набор реактивов «Apoptag», Chemicon, США. В качестве субстрата для пероксидазы был применен диаминобензидин (DAB). Апоптотические ядра приобретали коричневое окрашивание. После реакции для дополнительного прокрашивания интактных ядер срезы обрабатывали 0,5% метиловым зеленым. Срезы для гистологического исследования окрашивали гематоксилином и эозином.

Для определения фракций сфинголипидов по экватору глазных яблок отсекали заднюю часть, из которой экстрагировали общие липиды смесью хлороформ/метанол 2:1 по Фолчу. Для разделения липидов на классы использовали метод восходящей хроматографии в тонком слое силикагеля по Boath et al. (2010). Использовали систему растворителей бутанол: ледяная уксусная кислота: вода (3:1:1) на пластинах фирмы «Merсk» с УФ индикатором (Германия). Пластины проявляли в парах кристаллического йода. Локализацию фракций на пластинах определяли с помощью «свидетелей» – стандартных хлороформенных растворов сфинголипидов фирмы Avanti polar lipids (CША). Расчет параметров и количественная оценка хроматограмм проводилась с помощью программы «Sorbfil TLC Videodensitometer».

В день получения материала забирали артериальную кровь, центрифугировали ее при 1000 об/мин в течение получаса для получения плазмы. Из 1 мл плазмы экстрагировали общие липиды смесью хлороформ/метанол 2:1 по Фол-чу и с помощью описанной выше методики восходящей тонкослойной хроматографии по Boath et al. (2010) разделяли липиды на классы. Количественную оценку хроматограмм (содер-жание в пятнах церамида и сфингомиелина) проводили так же, как описано выше. В другой порции плазмы (0,2 мл) определяли содержание 11-оксикортикостероидов по Резникову А.Г., 1980. Для оценки достоверности различий в группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия выборок считали статистически достоверными при р<0,05. Анализ зависимости между признаками проводили с помощью расчета r – коэффициент корреляции (r-критерия Спирмена).

Результаты и обсуждение. Иммуногистохимическое исследование сетчатки глаз позволило обнаружить у 2-х из 10-и животных опытной группы отдельные ТUNEL-положи-тельные ядра в ганглиозном слое сетчатки. В других слоях сетчатки апоптотических ядер выявлено не было. Таким образом, вовлеченными в апоптоз оказывались только ганглиозные клетки сетчатки, что может свидетельствовать об их большей уязвимости в сравнении с другими популяциями клеток ретины. Для определения интенсивности апоптоза в ходе гистологического исследования производили подсчет количества ядер ганглиозных клеток в срезах при увеличении ×400 от 300 мкм до 1300 мкм от края решетчатой пластинки (рис. 1). Как видно из диаграмм, количество ганглиозных клеток под действием зоосоциального стресса уменьшалось, что оказалось статистически значимым в группе СН крыс.

Рис. 1. Количество ядер ганглиозных клеток сетчатки сетчатки СУ и СН крыс при 10дневном зоосоциальном стрессе (*- p<0,05 в сравнении с контролем; # -p<0,05 – межгрупповые различия)

В контрольной серии содержание церамида и сфингомиелина у СН животных достоверно не отличалось от его количества в исследуемых тканях СУ крыс. Под действием 10 и 18 дневного психосоциального стресса как в заднем сегменте глаза, так и в плазме содержание церамида достоверно увеличилось в обеих группах в сравнении с контрольной, а количество сфингомиелина достоверно уменьшалось (табл. 1, 2). В группе СН животных увеличение оказалось более выраженным, чем в группе СУ крыс. Различия между типами животных в обеих сериях оказались достоверными (p<0,05).

Таблица 1. Сфинголипиды в заднем сегменте глаза у крыс с разной стресс-устойчивостью при психоциальном стрессе (в мкг на 1 мг)

Примечание: здесь и далее *- p<0,05 в сравнении с контролем; # -p<0,05 – межгрупповые различия CУ – стрессоустойчивые, СН – стресснеустойчивые

Таблица 2. Сфинголипиды в плазме крови крыс с разной стресс-устойчивостью при психосоциальном стрессе (в мкг на 1 мл)

Для выявления наличия или отсутствия связи между изменением содержания изучаемых фракций липидов в структурах заднего сегмента глаза и плазме артериальной крови был проведен корреляционный анализ. При сравнении содержания церамида в заднем сегменте глаза и плазме крови была выявлена сильная прямая зависимость, как у СУ, так и у СН животных (r=0,91 и r=0,88 соответственно, p<0,05). Это, по нашему мнению, может указывать на системный характер происходящего под действием стресса изменения обмена исследуемых сфинголипидов.

Аналогичная по силе и направленности зависимость наблюдалась и при сравнении содержания сфингомиелина в заднем сегменте глаз и плазме крови у обоих типов животных – СУ и СН (r=0,82 и r=0,87 соответственно, p<0,05), что может быть объяснено расходова-нием сфингомиелина в реакции образования церамида и также указывает на системность про-исходящих изменений. Сильная обратная зависимость с высоким уровнем достоверности была выявлена между содержанием церамида и сфингомиелина в тканях заднего сегмента глаз СУ и СН животных (r=- 0,91, p<0,05 и r=- 0,8, p<0,05 соответственно). Однако подобной достоверной связи не удалось обнаружить между содержанием церамида и сфингомиелина в плазме крови обоих типов животных, что, вероятно, может указывать на активность иных путей метаболизма церамида и сфингомиелина в разных тканях организма.

Это приводит к ослаблению корреляционных взаимосвязей на системном уровне.

Выводы: в эксперименте обнаружено нарастание содержания проапоптотического фактора – церамида, признаки дегенеративных изменений ганглиозного слоя сетчатки под действием зоосоциального стресса, зависящие от стресс-резистентности животных. Это позволяет предположить, что длительные повторные эпизоды стресса или тяжелое стрессовое воздействие может привести к более выраженным дегенеративным изменениям в сетчатке за счет накопления свободных радикалов, нейротоксических агентов (эксайтотоксичность) или за счет увеличения генерации церамида, способного активировать апоптоз клеток сетчатки [3, 5].

Исследование поддержано грантом ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» №0002918.