Влияние экстрактов душицы обыкновенной и сабельника болотного на поведение модельных животных в тесте «открытое поле»

Оптимизация рациона имеет первостепенное значение в животноводстве и оказывает прямое влияние на эффективность отрасли. Стандартный расчет рациона включает в себя балансировку основных питательных веществ, микро- и макроэлементов [25]. Большую роль в обеспечении здоровья и продуктивного долголетия животных играют различные функциональные кормовые добавки, такие как ферментные препараты, про- и пребиотики, кормовые аминокислоты, фитобиотики и др. Особое значение такие добавки имеют в кормлении моногастричных продуктивных животных (свиньи и птица), так как их пищеварительная система более уязвима к факторам внешней среды [14].

Особый интерес для кормления представляют фитобиотики – природные биологически активные соединения растительного происхождения, используемые в кормлении животных [15]. Основным преимуществом фитобиотиков является широкий спектр проявляемых ими воздействий, что обуславливается биологически активными веществами, входящими в состав сырья конкретного растения. Разные фитобиотики способны проявлять противомикробные, фунгицидные, противовоспалительные, антиоксидантные, антистрессовые, противопаразитарные и другие свойства

• [9]. Наличие противомикробных и фунгицидных свойств позволяет рассматривать фитобиотики как перспективную альтернативу кормовым антибиотикам. Поиск добавок, способных

частично или полностью заменить антибиотики, является приоритетным направлением для исследований по ряду причин. Использование кормовых антибиотиков приводит к необходимости постоянно увеличивать их дозировку, снижает резистентность животных к факторам окружающей среды, а также приводит к большему образованию жировой ткани, чем мышечной, что значительно ухудшает качество мяса. Однако самая важная и опасная проблема антибиотиков – это их способность аккумулироваться в организме животных, не разрушаясь даже при последующей кулинарной обработке, передаваясь затем через цепочку питания в организм человека, увеличивая риск образования антибиотикорезистентных патогенов [1].

В качестве сырья для производства фитобиотиков перспективно использовать дикорастущие лекарственные растения, произрастающие на всей территории Российской Федерации и особенно распространенные на территории Сибири и Алтайского края [8]. Из обширного перечня растений, представленных на данных регионах, как компоненты для фитобиотических кормовых добавок можно выделить душицу обыкновенную (лат. Origanum vulgare L.) и сабельник болотный (лат. Comarum palustre L.). Согласно литературным данным, действующие вещества душицы обыкновенной способны проявлять антиоксидантные [22] и седативные свойства [24]. В научной литературе представлены данные, что применение сабельника болотного в ветеринарной практике способствует усилению естественной резистентности животных [16] и оказывает положительное воздействие на их организм при оксидативных стрессах [19]. Ранее проведенное нами исследование показало наличие у экстрактов сабельника болотного и душицы обыкновенной противомикробной активности, связанной, очевидно, с высокой концентрацией полифенольных соединений в их составе [10].

Прежде чем можно будет рекомендовать применение экстрактов лекарственных растений в качестве кормовой добавки, должны быть проведены первичные исследования на модельных животных, так как многокомпонентный состав действующих веществ может вызывать непредсказуемый эффект. Например, изменение привычного рациона способно спровоцировать у животных стресс и проявиться в виде изменений в поведении [3]. Поэтому актуальным остается изучение изменений в поведении животных в лабораторных условиях после введения в их рацион экспериментальных добавок. Одним из классических общеповеденческих тестов, позволяющих проводить комплексную оценку поведенческих характеристик животных, является тест «открытое поле» [17]. Данный тест служит в качестве платформы для изучения действия кормовых добавок [21], используется в опытах по моделированию индуцированного стресса и часто применяется для доклинической проверки на токсичность и эффективность биологически активных добавок и фармакологических препаратов [18].

Наиболее распространенным модельным животным для тестирования фармпрепаратов и кормовых добавок является лабораторная мышь ввиду ее быстрого развития и простоты содержания.

Цель настоящего исследования – изучение влияния экстрактов душицы обыкновенной и сабельника болотного на поведенческие показатели лабораторных мышей в тесте «открытое поле».

Материал и методы исследований . Экстракты душицы обыкновенной (ДО) и сабельника болотного (СБ) были изготовлены в физико-химической лаборатории Испытательного лабораторного комплекса Новосибирского государственного аграрного университета (НГАУ). Наземные части ДО и корневища СБ были собраны на территории Алтайского края в фазу цветения и предварительно высушены. Для исследования были использованы бесспиртовые экстракты ДО и СБ, изготовленные по собственной запатентованной технологии, включающей такие стадии, как измельчение, спиртовая экстракция, вакуумная фильтрация и дистилляция спирта на ротационном испарителе [11].

Исследование влияния экстрактов на поведение лабораторных мышей было проведено на базе Лаборатории структуры и динамики популяций животных Института систематики и экологии животных СО РАН. Объектом исследования стали 54 разнополые особи мышей линии ICR (аутбредные лабораторные мыши-альбиносы) возрастом два месяца. Животные были приобретены в Научно-исследовательском институте экспериментальной и клинической медицины (Новосибирск). Все эксперименты проведены с соблюдением правил научных исследований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Протокол исследования был одобрен комиссией по биологической этике Института систематики и экологии животных СО

РАН (протокол 2022-01 от 25.01.2022). Животные содержались в стандартных клетках (24×36×10 см) группами по три однополые особи при постоянном световом режиме (14 ч. света: 10 ч. темноты), комфортной температуре (22 – 24°C) и свободном доступе к воде и корму. Стандартный рацион животных состоял из гранулированного корма «ЧАРА» для лабораторных грызунов. Было сформировано три экспериментальные группы: мышам из контрольной группы в поилку добавляли только воду, грызунам из первой опытной группы помимо воды добавляли 20 мл/кг экстракта ДО, второй опытной – 20 мл/кг экстракта СБ.

До начала введения опытных экстрактов (фоновое тестирование) и в конце опыта (повторное тестирование) у всех особей была проведена оценка поведенческих показателей в тесте «открытое поле» [17]. Была использована установка, представляющая собой круглую арену с высотой борта 32 см и диаметром 63 см (изготовитель НПК Открытая Наука, Россия). Поведение животных фиксировали на видеокамеру (Panasonic HC-V720M), расположенную над ареной на высоте 1,5 м, с обязательным включением в кадр стенок арены. Визуально регистрировали латентное время выхода животного из центральной зоны арены, количество пересеченных им секторов отдельно для центра и периферии арены и общее (горизонтальная активность (ГА)), число вертикальных стоек (вертикальная активность (ВА)) и обнюхивания отверстий в полу арены, актов груминга (умывания), дефекации и уринации, также подсчитывали число фекальных болюсов. При математической обработке частоты отдельных актов поведения были логарифмированы ln(x+1) для уменьшения влияния уклоняющихся значений (единица прибавлена для учета нулевых значений) и для приведения выборки к нормальному распределению. Для получения интегральных характеристик поведения выборки обрабатывали методом факторного анализа с вращением осей «варимакс».

Критическим уровнем значимости принято значение P<0,05. В случае отсутствия значимых половых различий, соответствующие данные объединяли. Данные в тексте представлены как M±SEM, планки погрешностей на рисунках обозначают ошибки средних. Статистическую обработку этологических данных проводили с использованием критерия Манна-Уитни. Межгрупповую изменчивость анализировали с применением многофакторного дисперсионного анализа (Factorial ANOVA), дисперсионного анализа с повторными измерениями (Repeated measures ANOVA) и теста LSD из его арсенала. Формы изменчивости (половая, обусловленная принадлежностью к экспериментальной группе и повторностью тестирования) рассматривали как факторы, а признаки – как зависимые переменные. Все вычисления выполнены с использованием пакета статистического анализа данных STATISTICA12 и пакета анализа данных Microsoft Office Excel.

Результат исследований . В течение всего опыта у животных в экспериментальных группах не было обнаружено внешних патологий или проявлений атипичного поведения, которые могли бы говорить о физиологических или психоэмоциональных нарушениях. Значения этологических показателей мышей при фоновом тестировании представлены в таблице 1, самцов и самок рассматривали раздельно.

Значения этологических показателей после внесения в рацион исследуемых экстрактов представлены в таблице 2. Во всех группах (кроме самцов, потреблявших экстракт ДО) было обнаружено снижение латентного времени выхода животного из центральной зоны арены, снижение количества вертикальных стоек и суммарной ГА, увеличение количества актов груминга, дефекации (следовательно, и количества фекальных болюсов) и уринации (кроме самок, потреблявших экстракт ДО).

Таблица 1 – Этологические показатели при фоновом тестировании

Показатель	Контроль, x̅ ±S x̅		Душица, x̅ ±S x̅		Сабельник, x̅ ±S x̅
	♂	♀	♂	♀	♂	♀
Латентное время	6,89±1,20	5,89±0,69	4,56±0,92	6,67±1,31	5,44±1,58	6,56±1,48
ВА	17,00±3,55	23,00±2,70	21,33±4,11	16,11±3,94	21,00±5,17	13,44±3,42
ГА в центре	22,00±4,53	19,56±5,74	15,33±3,48	13,89±3,25	21,33±4,95	18,89±4,88
ГА       на периферии	66,56±7,82	65,22±3,66	68,33±6,39	64,33±4,15	65,00±9,11	71,78±5,58
ГА сумма	88,56±10,83	84,78±7,72	83,67±8,54	78,22±6,37	86,33±12,91	90,67±8,53
Груминг	0,11±0,11	0,11±0,11	0,11±0,11	0,22±0,15	0,22±0,15	0
Акты дефекации	1,22±0,58	0,22±0,16	0,22±0,16	0,89±0,45	1,33±0,31	1,11±0,41
Число фекальных болюсов	1,44±0,69	0,22±0,16	0,22±0,16	0,89±0,45	1,33±0,31	1,22±0,46
Уринация	0,33±0,25	1,56±0,39	1,00±0,47	1,11±0,37	1,22±0,63	0,89±0,21
Обнюхивание отверстий	15,56±2,06	12,78±1,84	15,44±1,79	11,78±2,36	10,22±1,36	11,11±1,53

Таблица 2 – Этологические показатели при повторном тестировании

Показатель	Контроль, x̅ ±S x̅		Душица, x̅ ±S x̅		Сабельник, x̅ ±S x̅
	♂	♀	♂	♀	♂	♀
Латентное время	3,56±0,59	2,89±0,60	4,89±0,80	3,78±1,07	2,67±0,56	3,22±0,79
ВА	7,89±2,81	11,56±3,07	11,67±2,84	10,56±2,24	13,89±3,37	8,89±2,25
ГА в центре	16,56±4,35	13,44±3,40	15,78±4,86	9,89±3,27	20,78±5,68	16,11±3,75
ГА на периферии	51,44±4,46	54,33±5,39	52,44±6,67	46,78±3,28	47,89±5,03	57,11±5,54
ГА сумма	68,00±8,20	67,78±7,18	68,22±11,19	56,67±4,56	68,67±9,25	73,22±8,03
Груминг	0,89±0,59	0,55±0,19	0,22±0,16	0,78±0,16	0,56±0,19	0,78±0,24
Акты дефекации	2,22±0,61	1,89±0,45	1,44±0,83	2,00±0,43	2,11±0,48	2,78±0,52
Число фекальных болюсов	3,33±0,97	2,22±0,58	1,44±0,83	2,22±0,49	2,22±0,46	3,11±0,62
Уринация	0,11±0,11	0,11±0,11	0,11±0,11	0,11±0,11	0,56±0,26	0,89±0,21
Обнюхивание отверстий	10,11±1,44	9,67±1,21	8,89±1,78	10,89±1,45	12,56±1,26	11,11±1,53

Для того чтобы отнести поведенческий акт к одной из функционально-мотивационных групп, был использован факторный анализ (Таблица 3). Основываясь на критерии «каменистой осыпи» (критерий Кэттела) и критерии интерпретируемости, выделяли и анализировали два главных фактора. Критической величиной факторной нагрузки принято значение 0,5. Степень вклада признака в формирование каждого фактора выражается в долях единицы. Интерпретация главных факторов сделана на основе коэффициентов корреляции признаков с компонентами [5]. Фактор двигательной активности был сформирован следующими элементами: горизонтальная и вертикальная активности, а также отрицательное значение латентного времени выхода животного из центральной зоны. Фактор эмоциональной активности включал следующие элементы: акты дефекации и число фекальных болюсов, что, по мнению автора установки «открытое поле» [20] свидетельствует об эмоциональности (подвижности нервной системы).

Таблица 3 – Факторный анализ поведения

Показатель	Фон		Конец опыта
	Двигательная активность	Эмоциональность	Двигательная активность	Эмоциональность
Латентное время	-0,53	0,01	-0,20	-0,28
ВА	0,71	0,07	0,80	0,08
ГА в центре	0,81	0,14	0,82	-0,06
ГА на периферии	0,82	0,04	0,88	0,08
ГА суммарная	0,92	0,08	0,97	0,04
Груминг	-0,08	-0,39	-0,16	0,30
Акты дефекации	0,10	-0,97	0,07	0,93
Число фекальных болюсов	0,09	-0,97	0,05	0,95
Уринация	0,45	-0,10	-0,16	0,29
Обнюхивание отверстий	0,13	0,06	0,49	-0,15
Объясненная дисперсия	29,17	19,32	28,67	17,10

Примечание. Значимые нагрузки (>0,50) элементов поведения на факторы выделены жирным шрифтом

Факторный анализ показал, что при повторном тестировании двигательная активность животных снизилась во всех группах, без значимого влияния опытных экстрактов. Установлено значимое (F2, 49=2,1 P<0,05) снижение эмоциональности у самцов, потреблявших экстракт ДО. При этом, после потребления экстрактов между экспериментальными группами наблюдались различия: у самцов, потреблявших экстракт ДО, эмоциональность была ниже, чем у самцов контрольной группы (P<0,05) и группы, потреблявшей экстракт СБ (P<0,05) (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Половые различия в поведении у разных экспериментальных групп при

повторном тестировании. * - P <0,05

Заключение.           Согласно литературным источникам, применение растительных экстрактов способно оказывать влияние на поведенческие показатели животных, в том числе оказывая анксиолитическое воздействие.

Кайгородцев А.В. изучал влияние водного и водно-этанольных экстрактов лабазника обыкновенного на поведение лабораторных мышей при моделях тревоги [7]. Противотревожное действие экстрактов оценивали рядом тестов, в том числе и тестом «открытого поля». Установлено, что водный и водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного оказывают выраженное противотревожное действие, снижая фактор эмоциональной активности в 1,5 раза в сравнении с контролем. Голоева Л.В. и соавторы изучали влияние экстракта элеутерококка на поведенческие характеристики лабораторных крыс в условиях пониженной температуры [4]. Вопреки ожиданиям исследователей, экстракт элеутерококка оказал не стимулирующее, а угнетающее по отношению к двигательной активности воздействие, что было интерпретировано авторами как проявление у подопытных животных под действием экстракта адаптогенных свойств в ответ на внешний стресс-фактор (низкая температура).

Снижение двигательной активности при повторном тестировании напрямую связано как с процессом взросления животных, так и со спадом эффекта «новизны». В исследовании Н.В. Вдовиной и соавторов [2] представлены данные, показывающие, что у молодых грызунов локомоторная и исследовательская активность выше, чем у взрослых особей. Также исследователями было отмечено, что двигательно-исследовательская активность наиболее высока при первичном тестировании животных. Был сделан вывод о том, что животные не «забывают» процедуры тестирования, при последующих тестах происходит спад эффекта «новизны» и грызуны ведут себя более осмотрительно.

Увеличение количества актов эмоциональной активности (груминга, дефекации, уринации) при одновременном снижении двигательной активности, вероятнее всего, связано с состоянием внутренней тревоги и страха животных и их низкой прогностической устойчивостью к эмоциональному стрессу [23]. Процедура тестирования оказывает на животных острое стрессовое воздействие, что особенно заметно при повторном тестировании, когда влияние эффекта «новизны» ослабевает и мыши демонстрируют угнетенное состояние, индуцированное хроническим стрессом [13].

Отличные от других групп паттерны поведения были зафиксированы у самцов из экспериментальной группы с ДО, у которых произошло статистически-значимое снижение эмоциональной активности. Это в совокупности с сохранением фонового уровня латентного времени выхода из центральной зоны арены может свидетельствовать о повышении их устойчивости к стрессу [6]. Данная устойчивость могла быть приобретена за счет седативного действия экстракта ДО. Подобный эффект был ранее выявлен при исследовании влияния экстракта ДО на крыс в условиях индуцированного хронического стресса [24]. При тестировании в «открытом поле» время активности в центральной зоне арены было значительно выше у мышей, подвергнутых стрессу и потреблявших экстракт ДО, чем у особей, подвергнутых только стрессу. Кроме того, применение экстракта приводило к значительному увеличению экспрессии белков BDNF и TrkB при снижении экспрессии TLR2 и TLR4 в префронтальной и гиппокампальной тканях крыс, что в результате выразилось в снижении их эмоциональной активности.

То, что седативные эффекты экстракта ДО, выявленные в нашей работе, были более выражены у самцов, связано, очевидно, с большей подверженностью самок тревожно-депрессивным расстройствам. Так, для самцов более характерна пассивная форма реагирования на сигналы опасности в виде замирания или торможения двигательной активности, а для самок - активные формы реагирования в виде убегания и избегания [12].

Выводы:

• 1.    Потребление опытных экстрактов не привело к гибели животных, проявлению внешних патологий или атипичного поведения, из чего можно сделать вывод об их безопасности в используемой в опыте дозировке;

• 2.    При повторном тестировании во всех группах было зафиксировано

• 3.    Экстракт сабельника болотного не оказал заметного влияния на поведение мышей обоих полов. Экстракт душицы обыкновенной проявил седативные свойства, снизив показатель эмоциональной активности у самцов и сохранив фоновые значения латентного времени выхода из центральной зоны арены. Данный эффект может быть использован для снижения стрессовых воздействий ветеринарных и технологических процедур на животноводческих предприятиях;

• 4.    Из полученных результатов можно сделать вывод о целесообразности дальнейшего изучения экстрактов душицы обыкновенной и сабельника болотного и их безопасности при использовании в составах функциональных кормовых добавок.

снижение двигательной и увеличение эмоциональной (кроме самцов, потреблявших экстракт душицы обыкновенной) активности. Вероятнее всего, это связано со спадом эффекта «новизны» и проявлением тревожности в процессе тестирования;

Финансирование: исследование выполнено в рамках выполнения второго этапа календарного плана программы поддержки коммерчески ориентированных научно-технических проектов молодых ученых «УМНИК-21», договор № 17983ГУ/2022 от 25.05.2022.