Влияние экстрактов лекарственных растений Байкальского региона на показатели иммунитета и гемостаза при экспериментальном иммунодефиците

Введение. Величайшее разнообразие биологически активных веществ растительного мира представляет неисчерпаемый ресурс для исследователей. Попадая в организм человека, данные соединения проявляют широкий спектр активности, обусловленный их способностью взаимодействовать с различными по своей природе сайтами связывания на клетках органов и тканей, в том числе и клетках иммунной системы [1; 2]. Молекулярные и клеточные механизмы действия лекарственных растений на процессы пролиферации, кооперации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, продукцию ряда ключевых цитокинов, определяющих выбор типа иммунного ответа, до сих пор окончательно не ясны и нуждаются в дальнейшем экспериментальном обосновании. Системы иммунитета, гемостаза и фибринолиза представляют собой единую клеточно-гуморальную защитную систему организма [3].

Цель работы — оценить влияние экстрактов некоторых лекарственных растений Байкальского региона на показатели иммунитета и гемостаза при экспериментальном иммунодефиците.

Методика. Исследования проведены на 58 половозрелых белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180–200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и приказу Минздрава России № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики». Перед началом экспериментов животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, распределялись на группы с учетом возраста, массы и принципа рандомизации. Все манипуляции с лабораторными животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977) и с соблюдением Европейской конвенции по защите животных (Страсбург, 1986). Тимэктомия проводилась по методике Т. Л. Соловьевой, 2006 [4]. Экспериментальные животные были распределены на следующие шесть групп: интактная (n=13), контрольная (крысы с индуцированной иммуносупрессией, вызванной тимэктомией, n=11), опытные группы — животные с иммуносупрессией, получавшие аптечный экстракт эхинацеи пурпурной (ЭП — Echinacea purpurea Moench.) (n=9), получавшие экстракт пятилистника кустарникового (ПК — Penthaphylloides fruticosa (L.) O. Schwarz) (n=9), получавшие экстракт бадана толстолистного (БТ — Bergenia crassifolia (L.) Fritsch.) (n=8), получавшие экстракт шлемника байкальского (ШБ — Scutellaria baicalensis (L.) Georgi.) (n=8). Фитоэкстракты получены И. Г. Николаевой (2001) [5]. Экстракты пятилистника и бадана содержат преимущественно дубильные вещества, экстракт шлемника — γ-пироновые соединения (флавоноиды).

Исследуемые экстракты растворяли в дистиллированной воде и вводили внутри-желудочно утром и вечером в течение 14 дней в дозе 300 мг на 1 кг массы, кон- трольная группа получала по аналогичной схеме эквиобъемное количество воды дистиллированной. Содержание про- и противовоспалительных цитокинов в крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением наборов фирмы «Вектор-Бест» (Новосибирск), показатели лимфоцитарнотромбоцитарной адгезии (ЛТА) — методом проф. Ю. А. Витковского и соавт. (2006) [6], показатели гемостаза (фибриноген, тромбиновое время (ТВ), протромбиновое (ПВ), активированное частичное тромбиновое время (АЧТВ), фибринолиз — реактивы «Технология-стандарт», Барнаул) — методами, описанными в руководстве по изучению системы гемостаза [7]. Для косвенной оценки иммуносупрессивного эффекта тимэктомии и влияния изучаемых экстрактов были оценены массы селезенки, надпочечников и брыжейки крыс.

Результаты всех измерений представлены в виде средних значений и стандартной ошибки (M±m). Исходные данные проверялись на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро — Уилка. Последующую обработку данных проводили с помощью пакета программ «Statistica 6.0» с использованием t-критерия Стьюдента. Различия между сравниваемыми группами считали статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты и обсуждение

В результате проведенного исследования установлено, что у животных контрольной группы концентрация провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-8, ФНО-α) снижалась почти в два раза по сравнению с их значениями в группе интактных. Статистически значимых изменений в концентрациях противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10) между данными группами не отмечено (табл. 1).

Таблица 1

Влияние фитоэкстрактов на цитокиновый профиль в сыворотке крови белых крыс, пг/мл (M±m)

	Провоспалительные			Противоспалительные
Группы	IL-1β	IL-8	ФНО-α	IL-4	IL-10
Интактная	15,84±0,56#	12,82±0,69#	13,23±0,45#	7,52±0,47	<1
Контрольная	7,61±0,44	7,27±0,35	7,44±0,32	5,11±1,21	<1
ЭП	7,88±0,38	6,89±0,58	7,22±0,33	9,70±1,12*	<1
ПК	5,68±0,46*	4,73±0,44*	4,97±0,45*	10,54±0,97*	9,62±1,31*
БТ	9,47±0,71*	8,21±0,38	8,20±0,46	3,67±1,42	6,84±1,55*
ШБ	7,29±0,39	6,25±0,48	6,65±0,52	3,45±0,91	<1

Примечание: # — здесь и далее показаны статистически значимые различия между контрольной группой и интактной (р≤0,05); * — статистически значимые различия между опытными группами и контрольной (р≤0,05).

На продукцию цитокинов влияли все изученные фитоэкстракты, кроме экстракта шлемника байкальского. Под влиянием экстракта пятилистника кустарникового происходило наиболее выраженное ингибирование синтеза провоспалительных ци- токинов. Так, содержание IL-1β в крови животных, получавших ПК, снизилось в 1,3 раза, а концентрации IL-8 и ФНО-α — в 1,5 раза по сравнению с контролем. Причем экстракт ПК значительно усиливал продукцию противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10. Таким же эффектом обладали экстракты эхинацеи пурпурной и бадана толстолистного, стимулируя синтез IL-4 и IL-10 соответственно.

Как видно из таблицы 2, показатели лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в контрольной группе животных были в 2 раза ниже, чем в интакной. Экстракты ЭП, ШБ и ПК оказывали стимулирующее влияние на ЛТА, причем максимальным эффектом по данному тесту обладал экстракт ЭП (9,55±0,29). Значимого влияния бадана на них не отмечено.

Таблица 2

Влияние фитоэкстрактов на показатели ЛТА у белых крыс, M±m

Группы	n	ЛТА, %	ЛТИ
Интактная	13	4,07±0,28#	3,11±0,18
Контрольная	11	2,05±0,27	2,45±0,38
ЭП	9	9,55±0,29*	2,44±0,19
ПК	9	5,22±0,57*	1,91±0,20
БТ	8	1,88±0,35	1,92±0,44
ШБ	8	7,22±0,41*	2,75±0,23

Для оценки иммуносупрессии и эффективности испытуемых фитоэкстрактов оценивалась масса иммунокомпетентных органов у крыс (табл. 3). Надпочечники не претерпели достоверных изменений в массе, введение животным экстрактов бадана и пятилистника привело к увеличению массы селезенки почти до значений в интактной группе. Масса брыжейки в группах, принимавших экстракты эхинацеи и шлемника, оказалась значительно ниже значений контрольной группы — 30±9 и 37±7 мг соответственно.

Таблица 3

Влияние фитоэкстрактов на изменения массы органов белых крыс, мг (M±m)

Группы	Селезенка	Надпочечники	Брыжейка
Интактная	930±42#	107±22	147±31
Контрольная	787±25	80±15	96±25
ЭП	825±31	77±17	30±9*
ПК	910±33*	62±15	86±12
БТ	873±26*	64±13	52±11
ШБ	704±29	104±28	37±7*

Удаление центрального органа, ответственного за клеточный иммунитет, привело к развитию гиперкоагуляции (укорочение ТВ, ПВ и АЧТВ), снижению антикоагулянтной активности крови и торможению фибринолиза (табл. 4). Наиболее значимые изменения наблюдали в группе животных, получавших экстракт ПК, где пока- затели коагуляции крови приближались к показателям в интактной группе. В других группах фибринолитическая активность оставалась угнетенной.

Таблица 4

Влияние фитоэкстрактов на показатели гемостаза и фибринолиза у белых крыс, (M±m)

Группы	ТВ (с)	ПВ (с)	АЧТВ (с)	XIIа-зависимый фибринолиз, (мин)	Эуглобулиновый фибринолиз, (мин)	Фибриноген, г/л
Интактная	29,3±3,1#	29,8±1,5#	28,3±1,1#	74±19	183±32#	2,83±0,19
Контрольная	21,7±1,4	25,2±1,3	25,5±0,7	96±27	238±16	3,12±0,18
ЭП	24,6±2,7	25,6±2,7	24,5±1,2	105±32	214±27	4,58±0,61*
ПК	34,5±3,6*	37,3±3,5*	32,5±3,3*	86±21	190±14*	9,63±1,37*
БТ	32,2±4,5*	31,2±4,2	27,4±2,4	112±33	233±44	5,75±0,72*
ШБ	26,8±3,2	24,4±2,1	25,9±1,5	89±17	229±37	4,71±0,53*

Слабыми прокоагулянтными свойствами обладал экстракт бадана толстолистного, увеличивая тромбиновое время. Изменения не коснулись показателей хагеман-зависимого фибринолиза, но в то же время во всех опытных группах отмечено повышение концентрации фибриногена, причем максимальное трехкратное увеличение наблюдалось в группе животных, получавших экстракт пятилистника кустарникового. Полученные факты свидетельствуют о том, что использование экстракта пя-тилистника приводит к нормализации показателей гемостаза при данном виде экспериментального иммунодефицита. Ранее показано, что предварительное введение тимэктомированным животным иммуномодулятора тималина, выделенного из вилочковой железы, а птицам — иммуномодулятора бурсилина, полученного из сумки Фабрициуса, не только ликвидирует явления гиперкоагуляции и депрессии фибринолиза, но и восстанавливает адекватный характер реагирования системы гемостаза на действие различных нейрогуморальных агентов [8].

Одним из новых высокоинформативных методов, дающих представление о состоянии иммунитета, является тест лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА) [6], которая наблюдается на ранних стадиях развития воспаления за счет активации тромбоцитов под действием медиаторов воспаления, в том числе и цитокинов. Про-воспалительные медиаторы, освобождаемые активированными моноцитами и макрофагами, такие как интерлейкины IL-1β, IL-2, IL-3, IL-6, IL-11 и TNF-α, а также эндотоксины в первую очередь воздействуют на эндотелий сосудов. В его клетках синтезируются молекулы адгезии, делающие поверхность эндотелия «липкой» — клетки приобретают провоспалительный и прокоагулянтный фенотип. Это, в свою очередь, приводит к активации тромбоцитов — ключевому событию не только гемостаза и тромбоза, но и воспалительного и иммунного ответов. В результате запускается замкнутый каскад реакций и возрастает риск тромботических осложнений [9].

В работе А. Н. Евстропова и соавт. (2004) показано интерфероногенное и иммуностимулирующее действие водорастворимого полифенольного комплекса из пяти-листника кустарникового. Водный экстракт растения повышал антителообразующую активность клеток селезенки мышей, иммунизированных эритроцитами барана, и стимулировал клеточный иммунный ответ [10]. Исследования А. А. Чурина и со-авт. (2005) в отношении полифенольного экстракта из бадана толстолистного ( Bergenia crassifolia Fritsch. ) показали нормализующий эффект препарата на содержание антителообразующих клеток селезенки мышей при иммунодепрессии и стимуляции гуморального иммунитета. Экстракт бадана снижал выраженность воспалительных процессов в условиях реакции гиперчувствительности замедленного типа, препятствуя накоплению Т-лимфоцитов в очаге воспаления и подавляя способность этих клеток продуцировать провоспалительные цитокины [11].

Ранее нами в экспериментах in vitro показаны цитокин-стимулирующие эффекты экстрактов пятилистника кустарникового и шлемника байкальского на культуре мо-нонуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров [12]. Кроме того, экстракты пятилистника и бадана вызывали увеличение продукции фактора Н — ключевого белка альтернативного пути активации системы комплемента, и неоптерина — косвенного показателя активации моноцитов-макрофагов [13]. Экстракт ШБ стимулировал продукцию оксида азота культивируемыми клетками.

Выявление механизмов регулирующего влияния растительных препаратов на клетки-эффекторы позволяет обосновать преимущественное направление их применения. Биологически активные вещества, содержащиеся в исследуемых экстрактах, связываясь со специфическими рецепторами (CD14, TLR-4), предположительно, могут приводить к выработке широкого спектра провоспалительных медиаторов, таких как цитокины (IL-1β, TNF-α), неоптерин и нитросоединения. Увеличение или уменьшение синтеза цитокинов в присутствии экстрактов может быть связано с взаимодействием компонентов экстрактов с так называемыми Toll-подобными рецепторами (TLR) на мононуклеарах, так как известно, что при контакте соответствующего лиганда с TLR запускается сигнальный каскад, приводящий к активации транскрипционного фактора NF-κB, что, в свою очередь, приводит к синтезу TNF-α и других провоспалительных цитокинов [14, 15].

Выводы. 1. Удаление центрального органа клеточного иммунитета проявляется значительными нарушениями в звеньях иммунитета и гемостаза у крыс, приводящими к изменениям цитокинового статуса и лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, массы иммунокомпетентных органов, развитию гиперкоагуляции, снижению антикоагулянтной активности крови и торможению фибринолиза.

• 2.    Исследованные фитоэкстракты проявляют иммунопротективные свойства, выражающиеся в оригинальном воздействии на показатели цитокинового статуса и лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.

• 3.    Экстракт пятилистника кустарникового нормализует показатели гемостаза и фибринолиза у тимэктомированных крыс.