Влияние эритропоэтина на выраженность азотемии и процессы свободнорадикального окисления при хронической почечной недостаточности

Уремическая интоксикация и оксидативный стресс являются непременными лабораторными атрибутами хронической почечной недостаточности (ХПН), определяющими клинико-инструментальные проявления и осложнения этого синдрома [7, 8, 12]. В качестве универсальных механизмов данных процессов рассматривают повышение активности прооксидантных и/или снижение активности антиоксидантных систем, преимущественно в плазме и клетках крови, а также ретенционный механизм развития эндогенной интоксикации. Сведения о влиянии процедуры гемодиализа на состояние процессов свободнорадикального окисления (СРО) противоречивы: ряд исследователей связывают активацию СРО с наличием азотемии при ХПН, другие считают, что процедура гемодиализа усиливает оксидативный стресс, присутствующий при уремии, а некоторые приводят сведения о снижении уровня метаболитов СРО в плазме после гемодиализа [14, 18, 22]. Малочисленны и неоднозначны сведения о связи компонентов про- и антиоксидантных систем с выраженностью азотемии при ХПН. В последние годы наблюдается интерес исследователей к плейотроп-ным эффектам эритропоэтина (ЭПО) у больных ХПН, многие из которых могут быть обусловлены его влиянием на выраженность окислительных процессов и уремической интоксикации [4, 9, 17, 19]. Вышесказанное определило цель исследования – в клинических и экспериментальных условиях показать при ХПН взаимосвязь процессов

СРО и выраженности азотемии и установить роль ЭПО в их коррекции.

Материалы и методы исследования . Клинический фрагмент выполнен на 62 больных ХПН, находящихся в отделении диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница» и получающих терапию на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы «Fresenius» (Германия) 3 раза в неделю в течение 4 ч, Kt/V 1,24 ± 0,01 мл/мин. Все больные ХПН были разделены на 4 основные группы: группа 2 – больные, не принимающие ЭПО до процедуры гемодиализа (n = 24); группа 3 – больные, не принимающие ЭПО после процедуры гемодиализа (n = 24); группа 4 – больные, принимающие ЭПО до процедуры гемодиализа (n = 38); группа 5 – больные, принимающие ЭПО после процедуры гемодиализа (n = 38). Больные 4-й и 5-й групп получали ЭПО в составе препарата «Рекор-мон» (МНН: эпоэтин бэта, «Roche», Швейцария) 2 раза в неделю внутривенно в дозе 2000–4000 МЕ в течение 2 месяцев. Суммарная доза введенного ЭПО составила около 50000 МЕ. Контрольная группа (группа 1, n = 25) представлена клинически здоровыми добровольцами – донорами областной станции переливания крови г. Челябинска.

Экспериментальный фрагмент работы выполнен на 45 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г. Модель ХПН у крыс создавали путем двухэтапной оперативной резекции 5/6 почечной ткани [13, 20]. ЭПО вводили внутрибрюшинно, начиная с 21-го дня, ежедневно в дозе 100 МЕ/кг

Таблица 1

Влияние ЭПО на содержание продуктов перекисного окисления липидов в гептановой фракции плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M ± m)

Показатель	Группа 1 здоровые (n = 25)	Группа 2 ХПН до диализа (n = 24)	Группа 3 ХПН после диализа (n = 24)	Группа 4 ХПН + ЭПО до диализа (n = 38)	Группа 5 ХПН + ЭПО после диализа (n = 38)
Е 220 , у.е./мл	1,72 ± 0,17	1,98 ± 0,17	1,95 ± 0,19	1,82 ± 0,19	2,31 ± 0,23
Е 232 , у.е./мл	1,03 ± 0,08	1,94 ± 0,15*	1,77 ± 0,14*	1,34 ± 0,15#	1,66 ± 0,18
Е 278 , у.е./мл	0,19 ± 0,02	0,44 ± 0,06*	0,49 ± 0,05*	0,27 ± 0,03#	0,28 ± 0,04^
Е 400 , у.е./мл	0,16 ± 0,02	0,25 ± 0,03	0,19 ± 0,01	0,14 ± 0,02#	0,11 ± 0,01^
Е 232 / Е 220	0,64 ± 0,02	1,10 ± 0,13*	1,34 ± 0,25*	0,72 ± 0,04#	0,69 ± 0,03^
Е 278 / Е 220	0,11 ± 0,01	0,24 ± 0,03*	0,29 ± 0,04*	0,18 ± 0,03	0,16 ± 0,03^
Е 400 / Е 220	0,11 ± 0,01	0,14 ± 0,02*	0,15 ± 0,03	0,08 ± 0,01#	0,15 ± 0,04

* – статистически значимые (р < 0,05) различия при сравнении с группой 1; # – с группой 2; ^ – с группой 3.

Таблица 2

Влияние ЭПО на содержание продуктов перекисного окисления липидов в изопропанольной фракции липидного экстракта плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M ± m)

Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 1 ХПН         ХПН ХПН + ЭПО Показатель здоровые до диализа после диализа до диализа (n = 25) (n = 24)           (n = 24)           (n = 38)	Группа 5 ХПН + ЭПО после диализа (n = 38)
Е 220 , у.е./мл    4,82 ± 0,59 9,68 ± 0,86*       8,79 ± 1,10*       11,41 ± 0,83*	8,10 ± 0,71*
Е 232 , у.е./мл    2,39 ± 0,30 7,08 ± 0,49*       6,02 ± 0,65*       6,22 ± 0,39*	5,66 ± 0,41*
Е 278 , у.е./мл     1,42 ± 0,11 2,94 ± 0,15*      2,37 ± 0,30* # 1,40 ± 0,07* #	0,77 ± 0,05* &
Е 400 , у.е./мл    0,26 ± 0,03 0,27 ± 0,04        0,30 ± 0,04        0,21 ± 0,03#	0,18 ± 0,03 ^
Е 232 / Е 220        0,51 ± 0,02 0,78 ± 0,09*       0,75 ± 0,07*       0,60 ± 0,04#	0,78 ± 0,09*
Е 278 / Е 220        0,30 ± 0,01 0,35 ± 0,03*       0,39 ± 0,07*       0,27 ± 0,01#	0,37 ± 0,05
Е 400 / Е 220        0,06 ± 0,01 0,04 ± 0,01*       0,06 ± 0,01*      0,02 ± 0,01* #	0,02 ± 0,01* ^

массы в течение 9 дней, суммарная доза 900 МЕ/кг. Контрольной группе ложнооперированных животных вводили эквиобъемное количество стерильного физиологического раствора. Исследования проводили на 30 сутки.

Концентрацию мочевины, мочевой кислоты и креатинина в плазме определяли на аппарате «Roki-6T» (Россия, Санкт-Петербург) с использованием реактивов фирмы «Human» (Германия), веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНиСММ) – на спектрофотометре «СС-104» (Россия) [5]. Уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме определяли спектрофотометрически с раздельной регистрацией липо-пероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта [1]. Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.) – Е232/Е220 (относительное содержание диеновых коньюгатов – ДК), Е278/Е220 (уровень кетодиенов и сопряженных триенов – КД и СТ) и Е400/Е220 (уровень оснований Шиффа – ШО). О состоянии антиоксидантной защиты судили по активности супероксиддисмутазы (СОД) [11] и каталазы сыворотки крови [6]. Стати- стический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0» с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни. При множественных сравнениях вводили поправку Бонферрони. Для выявления связи между параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена.

Результаты исследования и их обсуждение. У больных ХПН до процедуры гемодиализа происходит накопление продуктов ПОЛ в плазме (табл. 1, 2).

В гептановой фракции липидного экстракта плазмы, концентрирующей большую часть резервных липидов (триацилглицеридов), происходит накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ соответственно диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов, а также конечных продуктов ПОЛ – оснований Шиффа. В изопропанольной фракции липидного экстракта плазмы, аккумулирующей основное количество мембранных фосфолипидов, повышено содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Процедура гемодиализа не оказывает значимого

Осиков М.В., Григорьев Т.А., Агеев Ю.И.     Влияние эритропоэтина на выраженность азотемии влияния на уровень продуктов ПОЛ в липидных экстрактах плазмы.

Процессы СРО включают не только проокси-дантные системы, активность которых фиксируется по содержанию продуктов ПОЛ, но и систему антиоксидантной защиты с многочисленными представителями как в плазме, так и в клетках организма. У больных ХПН независимо от процедуры диализа в плазме снижается активность каталазы и СОД (табл. 3).

Отметим преимущественное снижение активности каталазы (в среднем на 64 %) по сравнению с СОД (в среднем на 49 %). Корреляционный анализ позволил установить, что содержание продуктов ПОЛ в плазме увеличивается по мере падения активности ферментов антиокислительной системы, причем, статистически значимые связи больше характерны для СОД, чем для каталазы (табл. 4).

Это согласуется с данными о значимости СОД как фермента «аварийного звена» антиоксидантной защиты [3]. Повышение активности НАДФН-оксидазы и депрессия функции СОД в ряде работ рассматривается как универсальный механизм окислительного стресса при ХПН [21]. Индивидуальный анализ уровня продуктов ПОЛ в липидном экстракте плазмы позволил установить, что и процессы свободнорадикального окисления… у большинства больных в исследуемой группе содержание продуктов ПОЛ в плазме после процедуры диализа снижалось. Такая тенденция наблюдалась в отношении всего спектра определяемых продуктов ПОЛ в плазме: первичных (у 16 больных из 24 как в гептановой, так и в изопропанольной фракциях), вторичных (в изопропанольной фракции у 18 больных) и конечных (у 15 больных).

У больных ХПН в плазме повышен уровень ВНиСММ в среднем на 159 % (табл. 5). Основным механизмом повышения уровня ВНиСММ является недостаточность их полного катаболизма и элиминации [10]. Наряду с ВНиСММ в плазме возрастает содержание мочевины и креатинина соответственно в 6 и 15 раз. Процедура гемодиализа снижает концентрацию ВНиСММ, мочевины и креатинина, но уровня здоровых людей они не достигают. Следует принять во внимание, что азотемия при ХПН приводит к дисфункции различных клеток организма, в том числе эндотелиоци-тов, фагоцитов, гепатоцитов, участвующих в генерации и элиминации оксидативных агентов, а активация процессов СРО является важным механизмом развития эндогенной интоксикации, что может замыкать один из circulus vitiosus при ХПН [2].

Таблица 3

Влияние ЭПО на активность ферментов антиокислительной системы плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M ± m)

Показатель	Группа 1 здоровые (n = 26)	Группа 2 ХПН до диализа (n = 24)	Группа 3 ХПН после диализа (n = 24)	Группа 4 ХПН + ЭПО до диализа (n = 38)	Группа 5 ХПН + ЭПО после диализа (n = 38)
СОД, ед./мл	0,87 ± 0,11	0,44 ± 0,02*	0,47 ± 0,02*	0,53 ± 0,03* #	0,51 ± 0,01*
Каталаза, мкат/л	17,88 ± 0,72	6,52 ± 0,47*	9,79 ± 2,49*	13,58 ± 2,00* #	12,51 ± 2,18* ^

* – статистически значимые (р < 0,05) различия при сравнении с группой 1; # – с группой 2; ^ – с группой 3.

Таблица 4

Корреляционная матрица между активностью ферментов антиокислительной системы плазмы и содержанием продуктов ПОЛ в липидном экстракте плазмы у больных ХПН

Показатель	Каталаза, мкат/л	СОД, ед./мл
Е 232 / Е 220 гептановая фракция	R = -0,50; р < 0,05 R=0	R = -0,63; р < 0,05 R = -0,04; р > 0,05
Е 232 / Е 220 изопропанольная фр.	R = -0,43; р < 0,05 R = -0,17; р > 0,05	R = -0,10; р > 0,05 R = -0,44; р < 0,05
Е 278 / Е 220 гептановая фракция	R = -0,31; р > 0,05 R = -0,30; р > 0,05	R = -0,51; р < 0,05 R = -0,55; р < 0,05
Е 278 / Е 220 изопропанольная фр.	R = -0,03; р > 0,05 R = -0,18; р > 0,05	R = -0,32; р > 0,05 R = -0,12; р > 0,05
Е 400 / Е 220 гептановая фракция	R = -0,01; р > 0,05 R = -0,41; р < 0,05	R = -0,55; р < 0,05 R = -0,18; р > 0,05
Е 400 / Е 220 изопропанольная фр.	R = 0,06; р > 0,05 R = -0,66; р < 0,05	R = -0,46; р < 0,05 R = -0,39; р > 0,05

Примечание. В числителе R – коэффициент корреляции Спирмена, р – показатель значимости связи до процедуры гемодиализа, в знаменателе – после гемодиализа.

Таблица 5

Влияние ЭПО на показатели эндогенной интоксикации в крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M ± m)

Показатель	Группа 1 здоровые (n = 25)	Группа 2 ХПН до диализа (n = 24)	Группа 3 ХПН после диализа (n = 24)	Группа 4 ХПН + ЭПО до диализа (n = 38)	Группа 5 ХПН + ЭПО после диализа (n = 38)
Мочевина, ммоль/л	4,98 ± 0,17	34,57 ± 1,94*	8,28 ± 0,72* #	27,52 ± 0,97* #	6,44 ± 0,41*л&
Креатинин, мкмоль/л	69,77 ± 2,09	1109,59 ± 43,42*	224,65 ± 9,86* #	816,58 ± 35,99* #	189,21 ± 6,21*л&
ВНиСММ, г/л	0,61 ± 0,02	1,58 ± 0,05*	0,70 ± 0,06* #	1,40 ± 0,07* #	0,77 ± 0,05*&

Установлено, что ЭПО изменяет содержание в плазме продуктов ПОЛ (см. табл. 1, 2). При исследовании уровня продуктов ПОЛ в гептановой фракции липидного экстракта плазмы выявлено, что до процедуры гемодиализа снижается содержание первичных и конечных интермедиатов ПОЛ. При анализе продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта плазмы выявлено в условиях применения ЭПО снижение всего спектра интермедиатов ПОЛ.

После процедуры гемодиализа в гептановой фракции плазмы снижается содержание только первичных и вторичных продуктов ПОЛ, в изо-пропанольной фракциях - конечных. Вероятно, в ходе процедуры гемодиализа дополнительная активация прооксидантных систем приводит к накоплению продуктов ПОЛ, преимущественно в изо-пропанольной фракции.

Полученные результаты могут свидетельствовать как о прямых, так и опосредованных эффектах ЭПО на выраженность процессов СРО у больных ХПН, находящихся на гемодиализе. Прямое действие ЭПО может реализоваться через вмешательство в активность клеток и плазменных факторов, входящих в состав про- и антиоксидантных систем, опосредованное - через увеличение количества эритроцитов, восстановление кислоро-дообеспечения клеток, снижение выраженности уремической интоксикации и другие факторы. В пользу предположения о прямом антиоксидантном эффекте ЭПО свидетельствует его влияние на активность ферментов антиоксидантной защиты (см. табл. 3). Отмечено повышение активности в плазме СОД и каталазы, причем, наблюдается более значимый прирост каталазы (+ 108 %), а не СОД (+ 20 %).

Ряд исследователей также высказывают предположение о прямом антиоксидантном действии ЭПО [15]. Полагают, что ЭПО может оказывать антиоксидантный эффект за счет активации антиоксидантного транскрипционного ядерного фактора-2 и как следствие изменение активности НАД(Ф)Н-оксидоредуктазы, глутатион-8-трансфе- разы-а1, гемоксигеназы-1 и глютатионпероксида-зы, а также снижение внутриклеточного содержания железа (II) [16, 23].

Нами установлено, что применение ЭПО у больных ХПН приводит к снижению выраженности эндогенной интоксикации, оцениваемой по содержанию ВНиСММ, креатинина и мочевины (см. табл. 5).

На фоне применения ЭПО до процедуры гемодиализа концентрация в плазме мочевины снижается на 20 %, креатинина - на 26 %. Незначительно, на 11 %, но статистически значимо уменьшается концентрация ВНиСММ, что является более информативным фактом, так как ВНиСММ объединяют гетерогенный пул метаболитов, накапливающихся в организме при ХПН. После процедуры гемодиализа на фоне применения ЭПО более значимо снижается концентрация креатинина и мочевины, но не ВНиСММ. Это связано с тем, что механизм молекулярного транспорта путем диффузии и ультрафильтрации во время гемодиализа обеспечивает преимущественное перемещение из крови низкомолекулярных агентов, а в составе ВНиСММ находятся также и крупные молекулы.

Для подтверждения дезинтоксикационного эффекта ЭПО при ХПН независимо от процедуры гемодиализа исследовали его влияние на показатели уремической интоксикации в плазме при экспериментальной ХПН (табл. 6).

Применение ЭПО приводит к уменьшению уровня креатинина и мочевины на 20 %, мочевой кислоты - на 13 %, при этом все показатели остаются выше, чем в группе ложнооперированных животных.

Установлено, что у больных ХПН, принимающих ЭПО, до процедуры гемодиализа некоторые показатели ПОЛ и активности антиокисли-тельных ферментов в плазме коррелируют с концентрацией уремических токсинов и ВНиСММ (табл. 7).

По мере снижения концентрации мочевины и креатинина в плазме снижается содержание вторичных и конечных продуктов ПОЛ в изопропа-

Осиков М.В., Григорьев Т.А., Агеев Ю.И.

Влияние эритропоэтина на выраженность азотемии и процессы свободнорадикального окисления…

Влияние ЭПО на показатели эндогенной интоксикации в крови крыс при экспериментальной ХПН (M ± m)

Таблица 6

Показатель	Группа 1 ложнооперированные (n = 16)	Группа 2 ХПН (n = 11)	Группа 3 ХПН + ЭПО (n = 16)
Мочевина, ммоль/л	5,98 ± 0,33	10,28 ± 0,80*	8,29 ± 0,40* #
Креатинин, мкмоль/л	95,28 ± 3,55	168,49 ± 10,09*	135,16 ± 3,06* #
Мочевая кислота, мкмоль/л	76,34 ± 5,86	99,25 ± 7,43*	86,33 ± 4,31* #

* - статистически значимые (р < 0,05) различия при сравнении с группой 1; # - с группой 2.

Таблица 7

Корреляционная матрица между показателями свободнорадикального окисления и показателями уремической интоксикации у больных ХПН до процедуры гемодиализа

Показатель	Креатинин, мкмоль/л	Мочевина, ммоль/л	ВНиСММ, г/л
Е232 / Е22о гептановая фр.	R = 0,07, р > 0,05	R= 0,07, р > 0,05	R = 0,14, р > 0,05
Е232 / Е220 изопропан. фр.	R= 0,22, р > 0,05	R= 0,19, р > 0,05	R = 0,02, р > 0,05
Е278 / Е220 гептановая фр.	R= 0,11, р > 0,05	R= 0,29, р > 0,05	R = 0,03, р > 0,05
Е278 / Е220 изопропан. фр.	R= 0,50, р > 0,05	R= 0,41, р > 0,05	R = 0,07, р > 0,05
Е400/ Е220 гептановая фр.	R= 0,13, р > 0,05	R= 0,16, р > 0,05	R = 0,24, р > 0,05
Е400/ Е220 изопропан. фр.	R= 0,43, р > 0,05	R= 0,19, р > 0,05	R = 0,10, р > 0,05
Каталаза, мкат/л	R= -0,46, р < 0,05	R= -0,45, р < 0,05	R = -0,44, р < 0,05
СОД, ед./мл	R= -0,49, р < 0,05	R= -0,57, р < 0,05	R = -0,28, р < 0,05

Примечание. R - коэффициент корреляции Спирмена, р - показатель значимости связи.

нольной фракции плазмы, а также нарастает активность каталазы и СОД в плазме, снижение ВНиСММ в плазме сопровождается только повышением активности антиокислительных ферментов. В целом, дезинтоксикационный эффект ЭПО в большей степени сопряжен с восстановлением активности ферментов системы антиоксидантной защиты, так как в данном случае наблюдаются наибольшее количество и сила связей между показателями.

Таким образом, в ходе проведенного исследования установлено, что у больных с терминальной стадией ХПН выраженность азотемии частично корригируется процедурой гемодиализа, развивается окислительный стресс, презентируемый накоплением продуктов ПОЛ и снижением активности ферментов антиокислительной защиты СОД и каталазы в плазме. Процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на активность процессов СРО в плазме. Применение ЭПО при ХПН приводит к снижению выраженности уремической интоксикации и окислительного напряжения в плазме. Антиоксидантный эффект ЭПО проявляется снижением уровня продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракциях липидного экс- тракта плазмы и повышением активности СОД и каталазы. Эфферентные свойства ЭПО проявляются при экспериментальной ХПН.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского гуманитарного научного фонда: проект 11-36-00352а2 «Оптимизация методов мониторинга и коррекции аффективных расстройств у больных хронической почечной недостаточностью».