Влияние контаминации формальдегидом на показатели иммунной системы у детей

Современные негативные тенденции в изменении показателей здоровья населения определяются комплексом факторов среды обитания [1, 4]. Иммунной системе принадлежит ведущая роль в обеспечении и поддержании гомеостаза организма, а также формировании согласованных реакций его отдельных систем в ответ на внешние воздействия, в том числе и на химические техногенные факторы среды [3, 11]. Следует отметить, что до настоящего времени нарушения иммунитета, или сбои в работе иммунной системы остаются малоизученными у детей, проживающих условиях техногенной нагрузки.

Цель работы: оценить влияние контаминации формальдегидом на показатели апоптоза у детей, проживающих на промышленно развитых территориях.

Материалы и методы. Исследование выполнено на примере детского населения, проживающего в различных условиях среды обитания. Группа наблюдения – 153 ребенка, проживающие в условиях экспозиции формальдегидом не менее 1 года (территория наблюдения). Группу контроля составили дети, проживающие на территории относительного санитарно-гигиенического благополучия, всего 121 ребенок (контрольная территория). Группа наблюдения и контрольная группа были сопоставимы по гендерному и возрастному составу, соматической заболеваемости. По социальнобытовым критериям выборка детей соответствовала среднему уровню материальной обеспеченности, жилищные условия отвечали гигиеническим нормативам. Выборка обследуемых была

достаточна для достоверного определения межгрупповых отличий. Биомедицинские исследования выполнены в соответствии с обязательным соблюдением этических принципов медикобиологических исследований, изложенных в Хельсинкской декларации 1975 г. с дополнениями 1983 г., с национальным стандартом РФ ГОСТ-Р 523792005. Исследование одобрено Этическим комитетом Федерального научного центра медикопрофилактических технологий управления рисками здоровью населения. Все родители (опекуны) подписали информированное согласие на участие в исследовании и использовании персональных данных.

Для выявления воздействия химических факторов среды обитания на состояние здоровья проведены натурные исследования содержания приоритетных загрязняющих веществ (формальдегид) в атмосферном воздухе на территории интенсивного промышленного освоения (территория наблюдения). Одновременно по этим же показателям были проанализированы пробы атмосферного воздуха на территории с минимальным техногенным воздействием (контрольная территория).

Химический анализ крови детей включал количественное определение содержания приоритетных загрязняющих веществ (формальдегида). Идентификация формальдегида в биосредах (кровь) выполнена методами газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии с методическими указаниями «Сборник методик по определению химических соединений в биологических средах», утвержденными Минздравом России 06.09.99. №763-99 – 4.1.779.-99. Для установления диапазонов ответных реакций иммунной системы на воздействие, дети, проживающие в условиях экспозиции, были поделены на группы с учетом содержания анализируемого компонента в образцах крови (группа I – содержание формальдегида в крови 0,001-0,009 мг/дм3, группа II – содержание формальдегида в крови 0,009-0,041 мг/дм3).

Фенотипирование лимфоцитов, идентификацию апоптоза проводили на проточном цитометре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» («BD», USA), с использованием универсальной программы CellQuestPrO с помощью компьютера Macintosh. Определение субпопуляций лимфоцитов (CD25+, CD95+ (FAS)) проводили методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием панели меченых моноклональных антител (МКАТ) к мембранным CD-рецепторам («BD», USA). Уровень апоптоза лимфоцитов определяли с помощью окрашивания аннексином V-FITC (Annexin V-FITC (Fluorescein Isothiocyanate)) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD (7-aminoactino-mycin D) согласно протоколу фирмы-производителя «Becman Coulter» («BС», USA). Для определения количества апоптотических клеток использовали суспензию мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина («Pharmacia Fine Chemicals», Sweden) [12]. Annexin V-FITC+7-AAD- – ранний апоптоз (апоптотические клетки), Annexin V-FITC+7-AAD+ – поздний апоптоз и некроз [8].

Для выбора критериев оценки значимости межгрупповых различий средних проверяли соответствие формы выборочных распределений нормальному, используя критерий χ², а также контролировали равенство генеральных дисперсий с помощью F-критерия Фишера. В случае отклонения от нормального распределения, для сравнения данных использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. При соответствии данных нормальному распределению использовали t -критерий Стьюдента. Результаты исследования представлены в виде среднего значения ( М ) и ошибки средней ( m ) изученных показателей. Во всех процедурах статистического анализа рассчитывался достигнутый уровень значимости (p ), при этом критический уровень значимости в данном исследовании принимался равным 0,05 [10].

Результаты и их обсуждение. В ходе инструментальных исследований зарегистрированы превышения гигиенических нормативов содержания формальдегида в атмосферном воздухе до 1,9 ПДК м.р. (предельно допустимая концентрация максимально разовая) и 3,8 ПДК с.с. (предельно допустимая концентрация среднесуточная), число проб с превышением гигиенических нормативов составило 6 %. На контрольной территории не выявлено превышений ПДК м.р. и ПДК с.с. формальдегида ни в одной из проанализированных проб. В крови детей, постоянно проживающих в зоне воздействия формальдегида, идентифицированы повышенные концентрации исследуемого компонента (0,0149±0,0006 мг/дм³) относительно фоновых значений (0,005±0,0014 мг/дм³) и значений, идентифицированных в биосредах детей контрольной группы. Сравнительный анализ уровня контами-нантной нагрузки биосред формальдегидом показал, что количество детей I группы с содержанием формальдегида в крови 0,001-0,009 мг/дм³ составило 26,9%, тогда как 73,1% группы наблюдения составили дети II группы с диапазоном концентраций формальдегида в крови 0,091-0,041 мг/дм³ (табл. 1). В условиях длительной экспозиции формальдегидом у экспонируемого населения в крови регистрируется формальдегид, который можно рассматривать как маркер экспозиции [6].

Анализ результатов исследования показал, что у детей I группы статистически значимо ( р <0,05) снижено абсолютное число CD95⁺-клеток и процентное содержание Annexin V-FITC⁺7-AAD⁺-клеток относительно контрольных значений. Обнаружено, что у обследуемых II группы статистически значимо ( р <0,05) снижена экспрессия CD25⁺-маркера, CD95⁺-маркера и количество Annexin V-FITC⁺7-AAD⁺-лимфоцитов, а также достоверно ( р <0,05) повышено процентное содержание Annexin V-FITC⁺7-AAD⁺-клеток в сравнении с анализируемыми показателями, полученными у детей контрольной группы.

Таблица 1. Диапазон значений маркера экспозиции формальдегидом и сопутствующие им диапазоны маркеров апоптотической регуляции у детей, проживающих в зоне внешнесредового воздействия формальдегидом ( M±m )

Примечание: р¹ - различие между контрольной и I группой по средним величинам р <0,05; р² - различие между контрольной и II группой по средним величинам р <0,05.

Анализ результатов исследования продемонстрировал, что у детей по мере возрастания в биосредах концентрации формальдегида изменяются активационные процессы и форма клеточной гибели. Апоптотическая реактивность организма способствует поддержанию баланса между количеством появляющихся и гибнущих клеток. Этот механизм, с одной стороны, помогает поддерживать клеточный гомеостаз, а с другой – препятствует продолжительному ответу клеток на антигены

[7]. Инициация и осуществление апоптоза активно подавляют развитие некроза в клетках, в частности, путем снижения ферментов, активность которых может приводить к запуску некроза [13]. Однако, если в клетках нарушены механизмы осуществления апоптоза, клетки погибают путем некроза. Существует сигнальный путь инициации некроза в ответ на связывание рецепторами таких молекул как TNF, на фоне подавления апоптоза [14]. Индуцировать программу некроза можно, если активировать программу апоптоза связыванием таких лигандов как FAS, либо вызывая гиперэкспрессию антиапоптотических белков. В то же время гибель клетки путем некрозом может быть не только вариантом гибели в условиях подавления апоптоза [9], но и выполнять функцию усиления иммунных реакций в ответ на антигенную стимуляцию [2, 5].

Выводы: формальдегид, идентифицированный в крови детей в диапазоне 0,001 мг/дм³-0,041мг/дм³, снижает активационные процессы и изменяет форму клеточной гибели: ингибирует гибель клетки по типу апоптоза и активирует гибель клетки путем некроза. Эффект, оказываемый формальдегидом на вариабельность активационных и апоптотических показателей иммунной системы, зависит от концентрации контаминанта.

• 4.

• 5.

• 6.

• 7.

• 8.

• 9.