Влияние модулированных ex vivo аминазином иммунокомпетентных клеток на гемопоэз при агрессии

Известно, что в результате хронического социального конфликта формируется аберрантное поведение, в частности агрессивное [1, 2], сопровождающееся перераспределением субпопуляций лимфоцитов в костном мозге в сторону увеличения количества СD4+-клеток при снижении количества СD8+-клеток [3], активацией миелопоэза, усилением миграции костномозговых клеток моноцитарного ряда на периферию и приобретением ими «воспалительного» фенотипа [4]. Приводятся данные, что этому способствует высокое содержание в крови у агрессивных животных одного из ключевых хемокинов, регулирующего миграцию моноцитов – моноцитарного хемоаттрактантного протеина (МСР-1) [3]. Более того, хемокины, включая МСР-1, представлены не только в иммунной системе, но и в мозге, где они могут играть роль нейромодуляторов [5]. Считается доказанным, что костномозговые моноциты способны мигрировать также и в головной мозг с последующей дифференцировкой в макрофаги М1-фенотипа, обладающие провоспалительной активностью [6, 7, 8]. Их воздействие на эндотелиальные клетки, нейроны и микроглию обусловливает повышенную продукцию цитокинов, хе-мокинов, молекул адгезии, что создает условия для ускорения аккумуляции мигрирующих в мозг костномозговых моноцитов. В этой парадигме резидентным иммунным клеткам (микроглии)

отводится роль источника нейровоспалительных сигналов [8, 9].

Активация микроглии с повышением продукции в мозге провоспалительных цитокинов, ключевых регуляторов настроения и поведения, изменяет нейрохимическую установку мозга, влияет на нейропластичность, а также индуцирует нейроэндокринные сигналы, модулирующие функционирование центральных и периферических иммунных органов [3, 10, 11]. Так, симпатическая нервная система, регулирующая физические реакции на ситуации борьбы/бегства, иннервирует ниши гемопоэтических стволовых клеток, расположенные в костном мозге и лимфоидных органах, с модуляцией дифференцировки и высвобождения лейкоцитов посредством в" адренорецепторного механизма [10, 12]. При этом гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая и ги-поталамо"гипофизарно"гонадная системы находятся между собой в антагонистических взаимодействиях, в силу чего нейробиологический профиль взаимоотношений данных систем смещается в сторону дисбаланса либо с высоким уровнем тестостерона и низким уровнем кортизола, либо с высоким уровнем кортизола и низким уровнем тестостерона.

В литературе приводятся убедительные сведения о том, что тестостерон и кортизол оказывают влияние на социальную агрессию [13, 14, 15, 16, 17]. В частности, показана отрицательная корреляционная связь между уровнем кортизола и показателями общей агрессии на различных когортах лиц [14]. Кроме того, высокие концентрации кортизола способны подавлять синтез серотонина и серотониновых рецепторов 1-го типа [18], что согласуется с данными об ингибирующем влиянии многократного опыта агрессии у самцов на серотонинергическую систему с тотальной активацией дофаминергической системы [1, 3, 10, 19], и может быть механизмом регистрируемых при этом изменений иммунологического статуса. Так, обнаружено, что базальное содержание Т-лимфоцитов и их субпопуляций (CD8 + и CD4 + ) у агрессивных и неагрессивных животных существенно различается. При этом агрессивная линия крыс по сравнению с неагрессивными имеет более высокий индекс реактивности (отношение CD4 + /CD8 + Т-лимфоцитов) в крови и селезенке, обусловленный пониженным содержанием CD3 + CD8 + Т-лимфоцитов, повышенную иммунную реактивность, проявляющуюся усилением цитотоксической активности NK-клеток селезенки, пролиферативного ответа спленоцитов на Т-зависимый антиген и гуморального иммунного ответа [3, 10].

Важным звеном, объединяющим функционирование нервной, иммунной и эндокринной си- стем, являются также цитокины, оказывающие влияние как на активность симпатической, гипо-таламо-гипофизарно-надпочечниковой и гипота-ламо-гипофизарно-гонадной систем, так и на центральные нейромедиаторные системы, включенные, как указывалось выше, в нейробиологиче-ские механизмы агрессивного поведения и играющие важную роль в психонейроиммуномодуля-ции [3, 10, 11, 20, 21, 22, 23]. Установлена прямая корреляционная связь между уровнями медиаторов воспаления и выраженностью агрессивного поведения [24]. С этими данными согласуются результаты собственных исследований, согласно которым при формировании агрессивной стратегии поведения в отдельных структурах головного мозга увеличиваются уровни провоспалительных цитокинов IL-1e, IL-2 и IL-6, а редактирование агрессивного поведения модулированными ex vivo аминазином сингенными спленоцитами сопровождается снижением нейровоспаления [25, 26, 27, 28]. При этом у агрессивных реципиентов показана также модуляция продукции цитокинов периферическими иммунокомпетентными клетками, что проявилось в снижении стимулированной митогенами продукции спленоцитами IFN-y, IL-2, IL-6 и IL-10 [29, 30]. Противоположные изменения уровней центральных и периферических цитокинов, наблюдаемые при формировании агрессивного поведения и его купировании, свидетельствуют о цитокин-опосредованном редактировании поведенческого фенотипа агрессивных реципиентов после трансплантации прекультиви-рованных с аминазином сингенных иммунокомпетентных клеток. Существенным звеном здесь может быть модуляция миелопоэза и миграции костномозговых клеток моноцитарного ряда в головной мозг и на периферию с приобретением ими «воспалительного» потенциала.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка костномозгового гемопоэза и клеточного состава периферической крови у экспериментальных животных при формировании агрессивного поведения вследствие хронического социального конфликта и после его редактирования модулированными ex vivo аминазином сингенными иммунокомпетентными клетками селезенки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на мышах-самцах (CBAxC57BL/6)F1 в возрасте 3-4 месяцев, полученных из питомника НИЛЭМ (Томск). Животные содержались в условиях лабораторного вивария в клетках по 5-10 особей, в течение не менее двух недель до начала эксперимента на стандартной диете, при свободном доступе к воде и естественном световом режиме. Все манипуляции выполняли в световой фазе цикла дня.

Исследования проведены с соблюдением норм современной биомедицинской этики и одобрены на заседании локально-этического комитета НИИФКИ. При выполнении исследования исполнителями были приложены все усилия, чтобы минимизировать количество животных, использованных в экспериментах.

Учитывая наличие в популяции самцов (CBA×C57BL/6)F1 особей с активным и пассивным типами поведения, представители которых характеризуются определенными структурнофункциональными характеристиками нервной и иммунной систем и различной психофизиологической реакцией на стрессовые воздействия [26], для формирования однородных групп используемых в исследовании экспериментальных животных все мыши были предварительно протестированы в соответствии со стандартной процедурой теста Открытое поле. В исследование были включены только особи с активным типом поведения, у которых в результате 20-кратного опыта побед в ежедневных агонистических взаимодействиях с пассивным партнером было сформировано агрессивное поведение (модель хронического социального конфликта) [2]. Формирование агрессивного поведения у мышей-самцов (CBA×C57BL/6)F1 было подтверждено поведенческим фенотипированием [31].

Агрессивные самцы (CBA×C57Bl/6)F1 использовались в последующих экспериментах, в том числе в качестве доноров и реципиентов иммунокомпетентных клеток. Спленоциты агрессивных доноров были выделены в стерильных условиях, обработаны in vitro аминазином и внутривенно введены сингенным агрессивным реципиентам, как это было подробно описано ранее [26, 27, 30, 31]. В контрольной группе агрессивных реципиентов подготовка и трансплантация иммунокомпетентных клеток селезёнки были проведены в аналогичных условиях эксперимента, за исключением того, что прекультивирование донорских клеток проводилось без аминазина. В качестве группы интактного контроля использовались мыши с активным типом поведения в соответствии с тестом Открытое поле.

Через 24 часа после трансплантации сингенных спленоцитов всех животных выводили из эксперимента путем декапитации. Для оценки количества костномозговых гемопоэтических предшественников костный мозг мышей вымывали из бедренной кости с помощью шприца кондиционной средой RPMI1640, содержащей 10% FCS. Подсчитывали количество клеток костного мозга (ККМ) в 1 мл с помощью гематологического анализатора PCE-90 (ERMA Inc, Japan). Для определения количества коммитированных предшественников клетки костного мозга животных в концентрации 2,0х104/мл инкубировали в 24-луночных планшетах в метилцеллюлозной среде М 3434 (Stem Cell Technology, Canada), содержащей цитокины SCF, EPO, IL-3, IL-6. Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ) и гранулоцитар-но-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарные (КОЕ-ГЭММ) колонии подсчитывали под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 37⁰С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, согласно рекомендациям Stem Cell Technologies (Canada). Полученные данные представлены как количество КОЕ/105 ККМ.

Клеточный состав периферической крови мышей оценивали на гематологическом анализаторе PCE-90 (ERMA Inc, Japan). Относительное количество форменных элементов крови подсчитывали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ SPSS 11.0. При анализе количественных данных проверку на нормальность распределения фактических данных проводили с помощью критерия Шапиро‒Уилка. Для каждой из непрерывных величин определяли среднее (М) и стандартное отклонение (SD). В ходе проведения сравнений независимых выборок при числе групп, равном 2, учитывая выявленное отклонение распределения от нормального в исследуемых группах, применяли критерий Манна‒Уитни. Для множественного сравнения показателей использовали критерий Крускала– Уоллиса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании принимался p≤0,05. Объем выполненных исследований позволял оценить результаты с достоверностью 95-99% при использовании соответствующих статистических методов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Формирование агрессивного поведения у мышей-самцов (CBA×C57Bl/6)F1 сопровождалось, как и ожидалось, оживлением в костном мозге миелоидной дифференцировки гемопоэтической стволовой клетки: количество гранулоцитарномакрофагальных предшественников (КОЕ – ГМ) значительно превышало таковое в костном мозге контрольной группы интактных мышей с активным типом поведения (рис. 1).

В результате усиления миелоидной дифференцировки в костном мозге в периферической крови агрессивных мышей наблюдалось значительное увеличение количества лейкоцитов и моноцитов (табл. 1). Усиление костномозгового гемопоэза, равно как и нарастание в периферической крови указанных клеточных популяций, по всей видимости, является следствием активации при стресс-индуцированной агрессии симпатического отдела вегетативной нервной системы [10, 12, 32].

Рисунок 1. Колониеобразующая активность костномозговых гемопоэтических предшественников агрессивных реципиентов (CBA×C57Bl/6)F1 после трансплантации сингенных спленоцитов, модулированных ex vivo аминазином

Примечание. КОЕ-ГМ - гранулоцитарномакрофагальные колонии. КОЕ-ГЭММ - гранулоци-тарно-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарные колонии. По оси ординат - количество КОЕ/105 клеток костного мозга. Обозначение столбиков: белые - интактный контроль (мыши с активным типом поведения); светло-серые - агрессивные мыши; тёмно-серые - агрессивные реципиенты после трансплантации спленоцитов, прекультивированных без аминазина (контрольная группа агрессивных реципиентов); чёр-

ные - агрессивные реципиенты после трансплантации спленоцитов, прекультивированных с аминазином (опытная группа агрессивных реципиентов). Статистические значимые различия по сравнению с соответствующим показателем в группе интактного контроля: ** - p<0,01; в группах агрессивных мышей и агрессивных реципиентов после трансплантации сингенных спленоцитов: #-# - p<0,01. Результаты представлены в виде M±SD; n=10-12 в каждой группе.

Как показано на рисунке 1, после трансплантации агрессивным самцам (CBA×C57Bl/6)F1 сингенных спленоцитов, прекультивированных без аминазина, объем популяции КОЕ-ГМ оставался на уровне такового у агрессивных мышей. Обработка выделенных у агрессивных доноров спленоцитов перед трансплантацией аминазином приводила к существенному снижению количества КОЕ-ГМ у сингенных агрессивных реципиентов практически до уровня интактного контроля. Вместе с тем не обнаружено статистически значимых различий между показателями количества ранних предшественников (КОЕ-ГЭММ) в костном мозге у агрессивных и интактных мышей-самцов (CBAxC57Bl/6)F1, равно как и у агрессивных реципиентов (CBA×C57Bl/6)F1 после трансплантации сингенных иммунокомпетентных клеток селезенки.

Таблица 1. Количество форменных элементов в периферической крови агрессивных реципиентов (CBA×C57Bl/6)F1 после трансплантации сингенных спленоцитов, модулированных ex vivo аминазином

Группа исследования	Лейкоциты (106/мл)	Моноциты (%)	Нейтрофилы (%)	Лимфоциты (%)
Интактный контроль (мыши с активным типом поведения)	6,9 ±1,4	1,1±0,3	17,1±2,0	62,0±3,0
Мыши с агрессивным поведением	12,3±2,8**	3,1±1,2**	26,3±4,3**	79,9±5,1**
Контрольная группа агрессивных реципиентов	10,2±2,1**	2,7±1,1*	20,9±6,4	74,3±8,0*
Опытная группа агрессивных реципиентов	7,3±2,5^	1,5±0,3^	15,6±4,4^	65,4±5,2^

Примечание. Контрольная группа агрессивных реципиентов - агрессивные реципиенты после трансплантации сингенных спленоцитов, прекультивированных без аминазина. Опытная группа агрессивных реципиентов -агрессивные реципиенты после трансплантации сингенных спленоцитов, прекультивированных с аминазином. Статистически значимые различия по сравнению с соответствующим показателем в группе интактных животных: * -p<0,05, ** - p<0,01; между соответствующими показателями в группах агрессивных мышей и агрессивных реципиентов после трансплантации сингенных спленоцитов: + - p<0,01. Результаты представлены в виде M±SD; n=10-12 в каждой группе.

Как видно из таблицы 1, формирование агрессивного поведения у мышей сопровождалось также увеличением количества сегментоядерных нейтрофилов, что наблюдается при воспалительных состояниях, в том числе связанных с хроническим стрессом [4, 33]. При этом наблюдалось и существенное нарастание в периферической крови популяции лимфоцитов, что согласуется с данными ранее опубликованных работ [3, 10].

Введение модулированных ex vivo аминазином спленоцитов от агрессивных доноров (CBA×C57Bl/6)F1 приводило у сингенных агрес- сивных реципиентов к значительному снижению количества моноцитов и лейкоцитов в периферической крови. Аналогичные данные были получены и в отношении популяции нейтрофилов. После трансплантации прекультивированных с аминазином спленоцитов корректировался также объем популяции лимфоцитов периферической крови, что может быть одним из механизмов продемонстрированного ранее снижения интенсивности гуморального иммунного ответа при указанном воздействии у агрессивных реципиентов [26, 27].

Усиление миелоидного направления дифференцировки при хроническом социальном стрессе обсуждалось ранее в зарубежных и отечественных публикациях [8, 33, 34]. У агрессивных самцов (CBA×C57Bl/6)F1 мы также наблюдали усиленный миелопоэз, что подтверждается большинством показателей.

Представленные данные могут свидетельствовать о корректирующем эффекте модулированных ex vivo аминазином спленоцитов агрессивных доноров (CBA×C57Bl/6)F1 на миелопоэз агрессивных сингенных реципиентов, что, очевидно, обусловлено продемонстрированным ранее снижением у последних уровня провоспалительных цитокинов [26, 27, 28, 29, 30]. По всей видимости, коррекция воспалительного статуса обеспечивает снижение количества гемопоэтических предшественников в костном мозге и ряда форменных элементов крови (моноцитов, лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов) [8].

Как вытекает из полученных результатов исследования, трансплантация спленоцитов, пре-культивированных без аминазина, не изменяет вышеуказанные показатели гемопоэза у агрессивных сингенных реципиентов (CBA×C57Bl/6)F1, а также не оказывает существенное влияние на показатели поведения реципиентов, функциональную активность их иммунокомпетентных клеток и цитокиновый статус в отличие от пре-культивированных с аминазином спленоцитов, как было изложено ранее в ряде опубликованных нами исследований [26, 27, 28, 29, 30, 31]. Вместе с тем изменение ex vivo аминазином функционального фенотипа иммунокомпетентных клеток селезенки агрессивных мышей придает указанным клеткам потенциал, в том числе модулирующий и гемопоэз при состоянии стресс-индуцированной агрессии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получены данные о том, что формирование агрессивной стратегии поведения у мышей-самцов (CBA×C57Bl/6)F1 сопровождалось существенным усилением в костном мозге гранулоцитарно-макрофагального (КОЕ-ГМ) направления дифференцировки гемопоэтической стволовой клетки и нарастанием в периферической крови популяций лейкоцитов, моноцитов, сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов.

Модулированные ex vivo аминазином сплено-циты агрессивных доноров (CBA×C57Bl/6)F1 после трансплантации сингеннным агрессивным реципиентам оказывали корректирующее воздействие на указанные показатели, снижая таковые практически до уровня, характерного для интактных животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена за счет средств федерального бюджета РФ, выделенных на выполнение фундаментальных научных исследований в ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», тема № 122011800324-4 (2021–2023).

СООТВЕТСТВИЕ ПРИНЦИПАМ ЭТИКИ

Исследования с животными проводились в соответствии с законодательством Российской Федерации, положениями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях, требованиями и рекомендациями Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных и одобрены на заседании локально-этического комитета НИИФКИ (протокол № 139 от 30.05.2022 г).