Влияние нейросенсибилизации на цито-, ангио- и синаптоархитектонику коры сенсомоторной области мозга крыс линии Крушинского - Молодкиной

Известно, что при травмах головного мозга, инфекционных заболеваниях, эпилепсии, судорожном синдроме, нейроинтоксикациях, нарушениях мозгового кровообращения, нейродегенеративных заболеваниях, паразитарных, онкологических заболеваниях головного мозга, у переживших гипоксию и клиническую смерть повышается проницаемость гематоэнцефалического барьера. Становится возможным контакт мозговых антигенов с органами иммуногенеза и антител мозгоспецифической направленности с мозгом, фиксация антител к антигенам мозга на нейронах, глиальных клетках, миелиновых оболочках, клетках эпендимы, стенках сосудов, пре- и постсинаптических мембранах. В результате нарушается когнитивная, ассоциативная и регуляторная функция центральной нервной системы. В связи с этим представляет интерес комплексное влияние нейросенсибилизации на качественные характеристики и количественные показатели цито-, ангио- и синаптоархи-тектоники коры сенсомоторной области мозга в эксперименте.

забуференном физиологическом растворе. Полученную взвесь оставляли на 18‒20 ч в холодильнике при 4 °С, после чего подвергали 5-кратному замораживанию при -70 °С и последующему оттаиванию на водяной бане при 37 °С. Гомогенат центрифугировали в течение 45 мин при 10 000 оборотов в мин на холоду, отсасывали надосадочную жидкость, разливали по флаконам по 0,5‒1,0 мл. Хранили при температуре -20 °С (не более 3 мес). Приготовленный таким образом супернатант водно-солевого экстракта мозга содержал наряду с мозгоспецифическими белками нейронов, глиоцитов, клеток эпендимы также антигены элементов сосудистой стенки, белков плазмы и тканевой жидкости. Ввиду тесной структурно-функциональной связи нейронов, глиоцитов и кровеносных капилляров мозга [1], сочетанного вовлечения их в патологический процесс при различных поражениях ЦНС, выявлении при этом антител, фиксирующихся на нейронах, глиоцитах, миелиновых оболочках, клетках эпендимы, стенках кровеносных сосудов [2], а также по причине того, что ряд мозгоспецифических белков локализуется и в нейронах, и в глиоцитах [3], не известно, какой мозгоспецифический белок (белки) играет решающую роль в патогенезе неврологических нарушений [4], допустимо использование в качестве антигенсодержащего материала супернатанта водно-солевого экстракта мозга. Это позволяет охватить максимальное число антигенных детерминант, содержащихся в экстракте мозга.

Сенсибилизацию крыс линии К‒М антигенами экстракта мозга проводили при помощи внутрибрюшинного введения супернатанта 20,0 %-ного водно-солевого экстракта гомологичного мозга в дозе 0,5 мг белка на 1 кг массы тела животного. Супернатант вводили один раз в день с интервалом в 2 дня 30-кратно.

Численную плотность функционально активных капилляров в слоях I‒III коры сенсомоторной области мозга крыс определяли на криостатных срезах, окрашенных на щелочную фосфатазу свинцовым методом по Гомори. Численную плотность нейронов, глиоцитов, гипо- и гиперхромных нейронов, гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней в коре больших полушарий определяли на окрашенных тионином по Нисслю срезах. Для определения численной плотности нервных и глиальных клеток в 1 мм3 коры больших полушарий использовали модифицированный метод Аbercrombie [5].

Для электронно-микроскопического исследования сенсомоторную кору головного мозга крыс (поля Fpa и Fpp) фиксировали погружением в смесь 1 %-ного раствора глютарового альдегида и 4 %-ного раствора параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5 %). Затем материал отмывали в фосфатном буфере в течение 1 ч, дофиксиро-вали в 1 %-ном растворе четырехокиси осмия в течение 2 ч, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Тангенциальные ультратонкие срезы коры контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Осмированный материал использовали для качественной и количественной оценки состояния нейронов и их отростков, синапсов, глиоцитов и кровеносных сосудов.

Изучение парамембранных специализированных образований пре- и постсинаптической частей системы субсинаптических единиц (ССЕ) – плотных проекций (ПП), постсинаптического уплотнения (ПУ) и синаптической щели проводили на контрастированном в 1 %-ном растворе фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК) на абсолютном спирте (100 %) материале [6; 7]. Ультратонкие срезы изучали и фотографировали на электронном микроскопе ЭМВ-100 АК. На полученных электронограммах определяли общую численную плотность синапсов на 100 мкм2 нейропиля, содержание симметричных, асимметричных и смешанных синапсов, плоских, искривленных синапсов. Кроме того, оценивали высоту ПП (типы А, В, С), длину активной зоны контакта (АЗК), площадь АЗК, площадь свободной от АЗК поверхности шипика (СПШ), отношение СПШ / АЗК, суммарную длину АЗК на 100 мкм2 нейропиля. Случайным образом выбранные участки среза фотографировали при стандартном увеличении ×15000. Обработку материала осуществляли на цифровых изображениях с помощью программы ImageJ 1.46.

Статистический анализ полученного материала проводили с использованием стандартного пакета прикладных статистических программ STATISTICA-6 [8]. Проверку статистических гипотез проводили с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Нулевая гипотеза отвергалась при p < 0,05.

Результаты исследований

Через 90 дней после начала нейросенсибилизации в коре сенсомоторной области выявлялись значительных размеров очаги выпадения нейронов, увеличивалось количество гиперхромных и в большей степени ‒ гипохромных нейронов и клеток-теней (табл. 1). Отмечалось выраженное набухание нейронов с увеличением ядра, вакуолизацией и лизисом периферического слоя цитоплазмы, узурация краев клеток. Изменения и выпадение нейронов носили диффузный характер.

На ультраструктурном уровне большинство нейронов имели вид электрон-ноплотных клеток с часто расположенными канальцами эндоплазматического ретикулума и увеличенным числом рибосом и полисом. Перинуклеарно выявлялись небольшие митохондрии с электронноплотным матриксом. Аппарат Гольджи представлялся в виде комплексов из расширенных канальцев и цистерн с большим количеством вокруг них мелких и крупных светлых пузырьков. В цитоплазме отмечалось увеличение числа электронноплотных первичных и вторичных лизосом, отек периваскулярных отростков астроцитов. Оболочка ядра нервных клеток выглядела извилистой, ядро ‒ многолопастным. Эти изменения преобладали в нейронах слоя V коры сенсомоторной области.

Таблица 1

Клеточный состав и численная плотность нейронов в 1 мм3 слоев III‒IV коры сенсомоторной области мозга крыс линии К‒М при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга, X ± m

Показатель	Группа животных
	Интактные (n = 8)	Сенсибилизация антигенами мозга (n = 8)
Общее число нейронов	74300 ± 6100	73593 ± 5493
Сморщенные нейроны и клетки-тени	2155 ± 177	112331922*
Гипер- и гипохромные нейроны	89161732	3441512826*
Глиальные клетки	9729812477	8095313847*
Глионейронный индекс	1,31	1,10

Примечание: В табл. 1‒6 символ «*») означает, что в сравнении с контролем различия статистически значимы при p < 0,05 (t ‒ критерий Стьюдента для независимых выборок). АЗК – активная зона контакта; ПП – плотные проекции; СПШ – свободная поверхность шипика. Материал представлен как среднее (M) ± стандартная ошибка средней (m).

Появились участки цитоплазмы нейронов, почти полностью лишенные рибосом и полисом. Гранулярный эндоплазматический ретикулум при этом был представлен отдельными беспорядочно ориентированными и расширенными цистернами, на мембранах которых неравномерно распределялись рибосомальные гранулы. Кариоплазма большинства нейронов была разрежена, осмиофобна с отдельными глобулярными скоплениями хроматина по периферии ядра.

На фоне уменьшения численной плотности глиальных клеток отмечался выраженный сателлитоз с явлениями нейронофагии, мелкоочаговые скопления глиальных клеток (табл. 2). Вокруг измененных нейронов и сосудов располагались активированные микро-глиальные клетки с электронноплотными лизосомами в цитоплазме. В цитоплазме тел и отростков глиальных клеток в большом количестве выявлялись гранулы гликогена. Количество органелл в цитоплазме астроцитов уменьшалось, чаще выявлялись лизосомы и липофусциновые гранулы. Микроглиальные клетки содержали гипертрофированный аппарат Гольджи с выраженным расширением цистерн и значительным количеством фагосом.

Таблица 2

Показатель	Группа животных
	Интактные (n = 8)	Сенсибилизация антигенами мозга (n = 8)
Число капилляров на 1 мм2	228,7 ± 8,7	194,6 + 9,0*
Длина капилляров в мм/мм3	457,4 + 13,4	389,3 ± 18,0*

Численная плотность функционально активных капилляров в слоях I‒III коры сенсомоторной области мозга крыс линии Крушинского ‒ Молодкиной при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга, X ± m

В капиллярах неокортекса отмечались фасетчатой формы ядра эндотелиальных клеток, участки лизиса мембранных и гранулярных образований, микропиноцитозные пузырьки в цитоплазме. В базальной мембране определялись участки просветления и разрыхления, отек периваскулярных отростков астроцитов. В расширенных перикапиллярных отростках астроцитов выявлялись множественные гранулы гликогена. Численная плотность функционально активных капилляров в слоях I‒III коры и синапсов в молекулярном слое сенсомоторной области по сравнению с интактными животными уменьшалась (табл. 3).

Таблица 3

Численная плотность контактов с различной организацией ССЕ в молекулярном слое коры сенсомоторной области мозга крыс линии К‒М при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга (ФВК-метод), X ± m

Показатель	Группа животных
	Интактные (n = 8)	Сенсибилизация антигенами мозга (n = 8)
Число синапсов на 100 мкм2 нейропиля: всего	17,69 ± 0,41	8,15 + 0,55*
асимметричных	14,54 ± 0,28	7,63 ± 0,44*
симметричных	3,15 ± 0,20	0,52 ± 0,17*
плоских	5,88 ± 0,42	4,47 ± 0,27*
искривленных	8,66 ± 0,17	3,67 ± 0,29*
Диаметр АЗК, нм	372,8 ± 34,3	797,7 ± 39,9*
Суммарная длина АЗК, нм	6595,2 ± 607,5	6501,3 ± 324,8

Значительно уменьшалось количество симметричных контактов. Соотношение плоских и искривленных синапсов не отличалось от контроля. Диаметр АЗК в 2 раза превышал контрольный уровень, что на фоне значительной редукции части синапсов не приводило к уменьшению суммарной длины контактов на 100 мкм2 нейропиля. Преобладали очень крупные контакты и множественные перфорированные синапсы, отсутствовали очень мелкие, мелкие и средние контакты (табл. 4), уменьшалось относительное содержание синапсов типа А с ПП более 60 нм (табл. 5).

Таблица 4

Численная плотность синапсов с различной длиной АЗК в молекулярном слое коры сенсомоторной области мозга крыс линии К‒М при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга (ФВК-метод), Х ± m

Длина активной зоны контакта, нм	Группа животных
	Интактные (n = 8)	Сенсибилизация антигенами мозга (n = 8)
< 200	1,01 ± 0,02	0
201‒400	7,92 ± 0,52	0
401‒600	4,50 ± 0,23	0
601‒800	3,24 ± 0,39	0,27 + 0,10*
> 800	1,02 ± 0,04	7,88 + 0,18*

Площадь АЗК выявляющихся синапсов и свободной от АЗК поверхности шипиков увеличивалась в 4,6 и 3,4 раза соответственно, а отношение СПШ/АЗК было в 1,35 раза меньше, чем в контроле (табл. 6). При этом уменьшалась четкость контуров ССЕ части синапсов, нарушалась структурная связь ССЕ с окружающей синаптоплазмой. В большей степени деструкции подвергались ПП, в меньшей ‒ ПУ. Деструктивные изменения варьировали от незначительного снижения четкости контуров ССЕ и высоты ПП до их фрагментации, отрыва ПП от пресинаптической мембраны и полного исчезновения ПП.

Таблица 5

Численная плотность асимметричных контактов с различной высотой плотных проекций в молекулярном слое коры сенсомоторной области мозга крыс линии К-М при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга (ФВК-метод), X ± m

Группы животных	Число синапсов с различной высотой ПП
	> 60 нм	60‒51 нм	50 нм и <
Интактные (n = 8)	7,26 ± 0,37	6,19 ± 0,29	4,24 ± 0,16
Сенсибилизация антигенами мозга (n = 8)	2,37 ± 0,26*	3,40 ± 0,25*	1,83 ± 0,27*

Таблица 6

Дендритные шипики молекулярного слоя коры сенсомоторной области мозга крыс линии К‒М при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга, X ± m

Показатель	Группа животных
	Интактные (n=8)	Сенсибилизация антигенами мозга (n=8)
Площадь АЗК, нм2	109111 + 926	499453 ± 1247*
Свободная от АЗК поверхность шипика (СПШ), нм2	278233 + 2361	943966 ± 2356*
СПШ/АЗК	2,55	1,89

Заключение

Таким образом, сенсибилизация антигенами супернатанта водно-солевого экстракта гомологичного мозга половозрелых крыс линии Крушинского ‒ Молодкиной вызывает деструктивные изменения нейронов, глиальных клеток, кровеносных сосудов и межнейронных контактов. При этом в коре сенсомоторной области в 5,2 раза по сравнению с контролем увеличивается количество гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней, в 3,9 раза ‒ гипер- и гипохромных нейронов. В 1,2 раза уменьшается численная плотность глиоцитов, 2,2 раза ‒ синапсов. В то же время в 2,1 раза увеличивается диаметр активной зоны контакта (АЗК), что поддерживает на контрольном уровне суммарную длину АЗК на 100 мкм2 нейропиля. Наряду со значительной гипертрофией сохранившихся синапсов выявляется отсутствие мелких и средних контактов, увеличение относительного содержания синапсов с высокими плотными проекциями, значительная гипертрофия дендритных ши-пиков и аксо-шипиковых синапсов, уменьшение в 1,4 раза отношения свободной поверхности шипика к АЗК. Выявленные при нейросенсибилизации качественные и количественные изменения цито-, ангио- и синаптоархитектоники сенсомоторной коры, очевидно, являются структурной основой функциональных нарушений центральной нервной системы.

V.V. Semchenko¹, S.I. Ereniev² , S.S. Stepanov²

• ¹The Omsk P.A. Stolypin State Agrarian University

• ²Omsk State Medical University

The impact of neurosensibilization on cyto-, angio- and synaptoarchitectonics of the cortex of the sensorimotor region of the brain of white rats