Влияние окислительного стресса на элементный статус тканевых компартментов органов регуляции минерального гомеостаза

Поиск новых методов и подходов управления адаптивными процессами в организме является одной из важнейших задач современной фундаментальной и прикладной физиологии [8]. Очевидно, что чем универсальней роль данных процессов, тем более широкий спектр нозологических единиц может быть показанием для потенциального коррекционного воздействия и тем большие перспективы открываются при направленном воздействии на мишень. Считается, что одним из таких универсальных процессов является окислительный стресс (ОС) [2, 8, 15]. ОС представляет собой совокупность структурнофункциональных модификаций биополи- меров, биомембран, метаболических сдвигов на уровне клеток, тканей и организма в целом, индуцированных высоким уровнем активных метаболитов кислорода (АМК), а также мембрано- и цитотоксических продуктов перекисного окисления биомолекул [9]. ОС реализуется в результате дисбаланса между интенсивностью реакций образования АМК, процессов свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ) и антирадикальных процессов, напрямую зависимых от состояния системы антиоксидантной защиты (АОЗ). ОС характерен для большинства критических состояний человека и животных, является важной составной частью развития синдрома эндогенной интоксикации. Повреждение мембран клеточных органелл способствует дисфункции внутриклеточных процессов и может явиться основой метаболических сдвигов в организме [4].

Считается, что в процессе адаптации организма при ОС включается комплекс многоуровневых внутриклеточных, органно-тканевых, системных, межсистемных механизмов регуляции и поддержания гомеостаза. Повышение активности системы антиоксидантной защиты и транспорта биогенных катионов являются первыми неспецифическими адаптивными реакциями любой живой системы. Необходимость изменения уровня активности трансмембранного переноса биогенных элементов связана с их участием в регуляции активности синтеза белков репарации, ферментов антиоксидантной защиты и многих других [5]. Элементный статус тканевых компартментов органов почек, тонкого и дистального отдела толстого кишечника (ДОТК), обеспечивающих поддержание минерального гомеостаза организма при окислительном стрессе не нашли должного отражения современной отечественной и зарубежной литературе [4, 13, 15]. Экспериментальное моделирование изменения состояния окислительновосстановительных процессов на лабораторных животных являются теоретической основой для понимания редокс-зависимых механизмов регуляции минерального гомеостаза и разработки эффективных методов управления данными процессами при окислительном стрессе.

Цель: изучить влияние глюкокорти-коид-индуцированного окислительного стресса на элементный состав тканей почек, тонкого и дистального отдела толстого кишечника крыс.

Материал и методы исследований. Исследование проводили на самцах крыс линии Вистар, массой 250-300 г. Эксперименты проведены с соблюдением правил гуманного обращения с животными согласно «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», принятой Советом Европы (Strasbourg, Франция, 1986) и директивой совета 86/609/ЕЕС от 24.11.1986 «По согласованию законов, правил и административных распоряжений стран-участниц в отношении защиты животных, используемых в экспериментальных и научных целях» с осуществлением хирургических вмешательств под эфирным ингаляционным наркозом и выведением животных из эксперимента передозировкой диэтилового эфира.

Крыс распределяли в 4 группы: интактная, контрольная и 2 группы сравнения (ГС), по 10 особей в каждой. Всех животных содержали в стандартных условиях вивария без ограничения доступа к воде и корму. Крысам контрольной и обеих ГС ежедневно в течение 14 суток вводили водную суспензию синтетического глюкокортикоида «Преднизолон Никомед» («Никомед Австрия ГмбХ», Линц, Австрия) в дозе 50 мг/кг с помощью внутри-желудочного зонда, инициируя у них развитие окислительного стресса [3]. Для чистоты эксперимента и стандартизации манипуляций, связанных с введением в организм веществ, крысам первой группы сравнения (1 ГС) через три часа после преднизолона вводили 0,2 мл водопроводной воды. Животные второй группы сравнения (2 ГС) по аналогичной схеме получали антиоксидант «Тиофан» (Ассоциация «Новосибирский институт антиоксидантов», Новосибирск, Россия) (в дозе действующего вещества 100 мг/кг массы), растворенный в 0,2 мл растительного масла производства ОАО «ЭФКО» торговой марки «Altero Golden». В связи с тем, что «Тиофан» – жирорастворимый антиоксидант, крысам контрольной группы после приема преднизолона внутрижелудочно вводили только растворитель антиоксиданта – растительное масло (0,2 мл).

На 15 сутки животных выводили из эксперимента. Для исследования элементного состава тканей у крыс всех групп забирали равные фрагменты тощей кишки (ТК), дистального отдела толстого кишечника (ДОТК) и левой почки массой 3-5 г. После забора образцов, удаления крови и очищения от содержимого кишечника, би-оптаты указанных тканей взвешивали с точностью до 5 мг, помещали в герметичную пластиковую лабораторную посуду и замораживали в морозильной камере при температуре – 18 °С. Все манипуляции по пробоподготовке осуществляли с целью переведения исследуемых образцов в растворенную форму, удобную для ввода в спектрометр. Растворение осуществляли путем обработки проб концентрированной азотной кислотой при открытом автоклавном разложении.

Определение элементного статуса биоматериалов проводили методом атомно-эмиссионного анализа (спектрометр «OPTIMA», шифр методики КХА: МУК

4.1.1482-03). Используемая методика основана на окислительно-кислотной, «мокрой» минерализации проб исследуемых биосубстратов и последующем ее анализе на требуемые химические элементы методом атомно-эмиссионной спектрометрии с использованием в качестве источника возбуждения высокочастотной индуктивно связанной аргоновой плазмы. В исследуемых образцах определяли содержание следующих биогенных элементов: Na, K, Ca, Mg, Fe, Zn и Cu.

Результаты статистически обрабатывали с использованием t -критерия Стьюдента и U -критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми принимались различия с достоверностью р≤ 0,05.

Результаты исследований. Кровь является важным компонентом внутренней среды организма и участвует в поддержании относительного постоянства ее состава [10]. Результаты изучения элементного статуса плазмы крови животных исследуемых групп показали, что длительное использование глюкокортикоидов приводит к значительному изменению концентрации макро- и микроэлементов в плазме крови по сравнению с соответствующими показателями интактных крыс (Табл. 1).

Таблица 1 – Содержание элементов в плазме крови крыс (ppm)

Группы животных	Na	K	Ca	Mg	Fe	Zn	Cu
Интактная	3064,00± 267,24	84,20± 2,24	108,83± 7,72	19,33± 0,66	4,94± 0,33	1,48± 0,08	1,50± 0,09
1 ГС	2253,00± 233,17*	95,77± 6,55	89,60± 4,27*	17,63± 0,26*	3,00± 0,11*	1,15± 0,01*	2,11± 0,93
2 ГС	2891,67± 256,55	81,93± 4,07	103,73± 5,21**	18,90± 0,44**	5,01± 1,27	1,38± 0,05**	1,46± 0,20
Контрольная	2304,25± 252,68	91,50± 3,28	110,20± 9,88	16,78± 0,49	2,49± 0,59	1,30± 0,44	1,99± 0,62

Примечание (здесь и в следующих таблицах): * – отличие показателей крыс I ГС от значений интактных крыс; ** - различия показателей животных I и II ГС; различия показателей животных I ГС и контрольной групп (р ≤ 0,05)

В образцах плазмы крови животных 1 ГС обнаружено статистически значимое понижение содержания Na, Ca, Mg, Fe и Zn и тенденция к повышению содержания К и Cu. Аналогичная динамика наблюдалась и в плазме крови крыс контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют о значительных гомеостатических сдвигах в организме в условиях глюкокор-тикоид-индуцированного окислительного стресса.

Применение антиоксиданта «Тио- фан» способствовало коррекции возникшего ионного дисбаланса. Так, в плазме крови крыс 2 ГС зарегистрировано достоверное повышение концентрации Ca, Mg и Zn, а также тенденция приближения концентрации остальных исследуемых элементов к значениям интактных животных.

В связи с тем, что электролитный состав плазмы крови является интеграль- ным показателем минерального гомеостаза организма, вызывало интерес изучение биоэлементного статуса органов, непосредственно участвующих в его регуляции – кишечнике и почках.

Содержание химических элементов в тканях стенки тонкого кишечника животных исследуемых групп представлено в таблице 2.

Таблица 2 – Содержание элементов в тканях тонкого кишечника крыс (ppm)

Группы животных	Na	K	Ca	Mg	Fe	Zn	Cu
Интактная	918,67± 46,55	3375,67± 73,10	183,25± 7,63	249,01± 7,23	48,67± 1,86	24,33± 0,34	1,20± 0,17
1 ГС	1327,00± 71,95*	3594,75± 88,54	156,33± 8,17*	277,33± 11,17*	44,25± 1,83	29,25± 1,22*	2,25± 0,15*
2 ГС	1100,00± 29,04**	3482,60± 15,96	173,80± 8,27	256,13± 12,12	49,40± 2,15	26,20± 1,08	1,48± 0,21**
Контроль ная	1298,50± 52,6	3796,50± 52,68	187,75± 10,22	264,20± 10,96	39,75± 2,44	28,75± 0,73	1,98± 0,14

В результате проведенного исследования обнаружено достоверное повышение содержания ионов Na в тканях стенки отдела ЖКТ. В связи с тем, что натрий является основным внеклеточным катионом, повышенное его содержание на фоне длительного применения глюкокортикоидов обусловливает обводнение тканевых структур слизистой оболочки и, вероятно, нарушение транспортной функции в тонком кишечнике.

Установлено снижение содержания Са в гомогенатах тощей кишки животных 1 ГС по сравнению с аналогичными образцами интактных крыс. Аналогичная динамика отмечена и в плазме крови. Указанные изменения, можно объяснить тем, что адсорбция Са осуществляется в проксимальном отделе кишечника совместно с фосфатами, всасывание которых во многом зависит от активности щелочной фосфатазы. Снижение активности данного фермента при окислительном стрессе в эн-тероцитах кишечника было отмечено ранее в работах ряда исследователей [12, 13]. Дефицит кальция, возможно, также связан с прямым влиянием АМК на гликокаликс, что приводит к снижению в нем содержания Са-связывающих белков [11].

У крыс, длительно получавших преднизолон, отмечается увеличение содержания Mg в тонком отделе ЖКТ. Однако в плазме крови концентрация этого элемента значительно снижалась. Учитывая конкурентные взаимоотношения в организме между Mg и Са, можно предположить, что повышение содержания Mg происходит на фоне снижения содержания Са. В то же время, следует отметить, что Mg преимущественно всасывается в дистальном отделе толстого кишечника, где важную роль играют витамины группы В. Их содержание тесно связано с микробиоценозом толстого кишечника. Вероятно, дисбактериоз, обусловленный окислительным стрессом [13] и нарастающий гиповитаминоз [14], является определяющим фактором снижения концентрации данного элемента в плазме крови.

Как показали исследования, содержание Сu в тонком кишечнике крыс 1 ГС достоверно превышало таковое у интактных животных. Принимая во внимание, тот факт, что Сu адсорбируется, главным образом, в желудке, можно предположить, что под действием АМК усиливается ее экскреция в этом отделе кишечника. Из литературных источников известно, что преобладающая часть поступающей в организм Сu выводится с калом. Из общего количества эвакуируемой Сu большая часть является невсосавшейся, оставшаяся – эндогенного происхождения, выделенной с желчью и кишечным секретом [1, 13]. Учитывая тот факт, что основным депо Сu является печень, можно предположить, что при нарушении структурнофункциональной организации печени АМК наблюдается значительный выход этого катиона из депо на фоне нарушения редокс-гомеостаза [2]. Не исключено, что эти процессы также приводят и к повышению концентрации Сu в плазме крови.

В исследуемом отделе ЖКТ крыс, длительно получавших глюкокортикоиды, содержание Zn достоверно превышало соответствующие значения интактных животных. При этом в плазме крови крыс концентрация элемента снизилась. В публикации Авцына А.П. и др. (1991) [1] показано, что основным органом всасывания Zn является подвздошная кишка, где адсорбируется до 60 %, а в тощей кишке – до 30 % от общего количества всосавшегося элемента. Значительные потери Zn наблюдаются при слущивании эпителия, а при воспалительных процессах в кишечнике под влиянием лейкоцитарного эндогенного медиатора ИЛ-1 происходит снижение концентрации Zn в плазме крови и накопление в печени.

Применение антиоксиданта «Тиофан» способствовало приближению количества исследуемых элементов в тканях тощей кишки к значениям интактных животных. Статистически значимые изменения отмечены в содержания Na и Cu.

Согласно современным представле- ниям, развитие окислительного стресса во многом связано с дисбалансом микроэлементов, так как многие биоэлементы влияют на активность таких ключевых ферментов системы антиоксидантной защиты [12, 13].

Толстый отдел кишечника участвует в поддержании минерального гомеостаза организма, а его симбиотическая микрофлора при этом во многом влияет на всасывание микроэлементов. Именно поэтому оценка элементного статуса терминального отдела пищеварительного тракта имеет большое значение в условиях ГКОС [13].

В результате изучения биоэлемент-ного состава гомогенатов дистального отдела толстого кишечника крыс 1 ГС было установлено статистически значимое увеличение содержания всех исследуемых ионов, за исключением Fe, уровень которого имел лишь тенденцию к повышению (Табл. 3).

Таблица 3 – Содержание элементов в тканях дистального отдела толстого кишечника крыс (ppm)

Группы животных	Na	K	Ca	Mg	Fe	Zn	Cu
Интактная	723,67± 87,24	3059,60± 92,04	307,00± 12,76	141,02± 7,69	35,02± 2,10	27,33± 1,03	1,47± 0,48
1 ГС	1133,67± 54,14*	3566,33± 107,59*	345,67± 7,38*	265,67± 20,69*	38,00± 1,03	37,00± 1,38*	3,06± 0,62*
2 ГС	811,00± 73,46**	3114,50± 117,56**	311,25± 9,49**	148,43± 5,01**	39,11± 3,50	30,20± 0,77**	1,98± 0,34
Контроль ная	1055,00± 94,88	3424,33± 97,58	340,40± 13,50	257,60± 12,31	40,75± 4,15	47,25± 1,46	2,96± 0,38

Известно, что при ГКОС происходит повреждение структур слизистой оболочки ДОТК [10], следствием которого является повышение проницаемости кишечного барьера [12] и массивное всасывание кишечных эндотоксинов. Эти соединения способны стимулировать мононуклеарные клетки слизистой оболочки кишечной стенки. Они, в свою очередь, усиленно вырабатывают провоспалительные интерлейкины, которые вызывают необратимую инактивацию ферментов, структурную перестройку клеточных мембран, изменение их проницаемости вплоть до гибели кле- ток. Это, безусловно, сопряжено с нарушением процессов ионного транспорта, в связи с чем в организме возникает дефицит биоэлементов.

Полученные результаты согласуются с данными проведенных нами ранее экспериментов по изучению процессов транспорта макро- и микроэлементов в толстом кишечнике при ГКОС. Было установлено, что у животных 1 ГС уровень абсорбции всех макроэлементов достоверно превышает соответствующие показатели исследуемых образцов крыс интактной группы. Если учесть, что данный отдел кишечника, наряду с почками, играет ключевую роль в поддержании водно-ионного гомеостаза организма, повышение абсорбции ионов Na и K, и, как следствие, их содержания в образцах тканей ДОТК, с нашей точки зрения, может рассматриваться в качестве адаптивного механизма, направленного на поддерживание минерального обмена. Считается, что всасывание Ca и Mg в этом отделе кишечника осуществляется преимущественно без затрат энергии через специализированные каналы. Можно полагать, что повышение абсорбции Ca и Mg в толстом кишечнике является следствием недостаточного поступления этих ионов в организм при снижении интенсивности энергозависимого транспорта в других отделах ЖКТ, а также реабсорбции в нефроне. В связи с тем, что толстый кишечник не является основным органом всасывания Ca, повышение интенсивности абсорбции этого иона при окислительном стрессе может инициировать активацию Ca-зависимых протео- и липолитических процессов в клетке, кото- рые всегда сопровождаются повышенным уровнем СПОЛ.

Повышенное содержание микроэлементов в гомогенатах ДОТК может быть связано с высвобождением их из тканевых депо и последующим транспортом в колоноциты для обеспечения физиологических процессов в клетке.

Известно, что толстый отдел кишечника не приспособлен для ферментативного переваривания пищи, поэтому секреция данных катионов не связана с необходимостью их участия в синтезе пищеварительных ферментов. С нашей точки зрения, повышенная секреция исследуемых микроэлементов обусловлена включением их в состав активных центров ферментов антиоксидантной защиты КАТ и СОД.

Анализ элементного состава образцов ДОКТ животных 2 ГС, получавших на фоне приема преднизолона антиоксидант «Тиофан», свидетельствует о коррекции нарушений ионного транспорта в исследуемом сегменте ЖКТ. Это заключение можно сделать на основании зарегистрированного снижения содержания макро- и микроэлементов в тканях толстого кишечника и приближения указанных значений к показателям интактных крыс.

Изучение элементного состава тканей почки крыс 1 ГС показало, что длительное использование глюкокортикоидов приводит к значительному снижению содержания макро- и повышению содержания микроэлементов (Табл. 4) относительно значений интактных животных.

Таблица 4 – Содержание элементов в тканях почки крыс (ppm)

Группы животных	Na	K	Ca	Mg	Fe	Zn	Cu
Интактная	1398,75± 25,12	3236,50± 24,39	30,75± 2,24	155,67± 5,86	33,50± 8,54	18,00± 1,54	7,65± 0,44
1 ГС	1272,33± 27,93*	2632,33± 19,66*	20,33± 1,38*	141,02± 0,69*	84,00± 10,73*	26,00± 0,49*	10,03± 1,10
2 ГС	1326,25± 31,22	3061,40± 33,27**	28,20± 6,73	145,20± 3,81	48,00± 3,85**	21,50± 0,98**	7,90± 1,17
Контрольная	1296,40± 24,04	2502,25± 30,24	16,50± 9,51	138,43± 5,01	88,00± 4,14	27,00± 0,69	10,40± 1,90

В наших ранних исследованиях ионоуретической функции почек крыс, длительно получавших преднизолон, было показано снижение фоновой экскреции с мочой Na и K по сравнению с животными интактной группы. С нашей точки зрения, это могло быть обусловлено как снижением фильтрационной загрузки нефронов, так и нарушением концентрационно-реабсорбционных процессов в канальцах [7]. Обнаруженное изменение ионного состава тканей почки, нарушение гидро- и ионоуретической функций и изменение ионо-осмотических показателей плазмы крови у животных, длительно получавших глюкокортикоиды, могут объясняться повреждением клеток и межклеточного вещества паренхимы почек преимущественно активными метаболитами кислорода при окислительном стрессе.

Повышение в исследуемых образцах почки содержания Fe, Zn и Cu можно объяснить тем обстоятельством, что эти элементы являются активными центрами молекул ключевых ферментов антиоксидантной защиты организма – каталазы и супероксиддисмутазы, адаптивное повышение активности и/или синтеза которых происходит в ответ на повреждающее действие АМК. Значительная роль свободнорадикальных процессов в развитии нефропатии подтверждается коррекцией гомеостатических показателей плазмы крови и элементного состава почек при использовании антиоксидантного соединения «Тиофан».

Заключение. Результаты проведенного исследования показали, что при ГКОС происходит статистически значимое изменение элементного состава плазмы крови, тканей тонкого, дистального отдела толстого кишечника и почек, что является признаком редокс-зависимого нарушения минерального обмена.

При сочетанном использовании глюкокортикоидов и антиоксиданта «Тиофан» отмечается коррекция негативных изменений элементного состава плазмы крови, тканей исследуемых органов и их приближение к значениям интактных крыс. Использованный в работе подход позволяет считать, что применение синтетического серосодержащего полифункци-онального антиоксиданта «Тиофан» на фоне глюкокортикоид-индуцированного окислительного стресса оптимизирует процессы свободнорадикального перекисного окисления липидов в плазме крови и тканевых компартментах, обеспечивающих регуляцию минерального гомеостаза организма.

Экстраполяция полученных в эксперименте, на лабораторных животных, закономерностей на сельскохозяйственных животных позволяет признать важную роль окислительного стресса в нарушении структурно-функциональной организации почек, тонкого и дистального отдела толстого кишечника, обеспечивающих поддержание минерального гомеостаза организма. Применение антиоксиданта «Тиофан» является одним из методов управления редокс-зависимыми механизмами нарушения минерального гомеостаза в условиях ОС.

Резюме

Настоящая работа посвящена изучению элементного состава тканей органов, участвующих в регуляции минерального гомеостаза организма – почек, тонкого и дистального отдела толстого кишечника крыс в условиях глюкокортикоид-индуцированного окислительного стресса. Развитие окислительного стресса у животных инициировали путем ежедневного, в течение 14 суток, внутрижелудочного введения водной суспензии синтетического глюкокортикоида «Преднизолон» («Никомед Австрия ГмбХ», Австрия) в дозе 50 мг/кг. Определение элементного статуса биоматериалов проводили методом атомно-эмиссионного анализа с индуктивно связанной плазмой (спектрометр «OPTIMA», шифр методики КХА: МУК 4.1.1482-03). В пробах плазмы крови и исследуемых образцах тканей определяли содержание следующих биогенных элементов: Na, K, Ca, Mg, Fe, Zn и Cu. Установлено, что при глюко-кортикоид-индуцированном окислительном стрессе происходит статистически значимое изменение элементного состава плазмы крови, тканей тонкого, дистального отдела толстого кишечника и почек, что свидетельствует о редокс-зависимом нарушении минерального обмена. При сочетанном использовании глюкокортикоидов и антиоксиданта «Тиофан» отмечается коррекция негативных изменений элементного состава плазмы крови, тканей исследуемых органов и их приближение к значениям интактных крыс. Использованный в работе подход позволяет считать, что применение синтетического серосодержащего полифункциональ-ного антиоксиданта «Тиофан» на фоне глюкокортикоид-индуцированного окислительного стресса оптимизирует процессы свободнорадикального перекисного окисления липидов в плазме крови и тканевых компартментах, обеспечивающих регуляцию минерального гомеостаза организма.