Влияние преаналитических процедур на величину бактерицидной активности слюны жвачных животных

Последнее десятилетие характеризуется активизацией исследований иммунологии полости рта, в основе которой лежит учение о местном иммунитете слизистой оболочки рта. Последняя служит барьерным приспособлением для защиты организма от вредных агентов, т.е. обеспечивает естественную резистентность организма. Защитную роль играют как микрофлора, заселяющая слизистую оболочку рта, так и слюна [8,  7,  1]. Неспецифический иммунитет полости рта определяется клеточными и секреторными элементами слюны. К последним относятся лизоцим, комплемент, катионные антимикробные пептиды и др. [4, 6, 5].

Бактерицидные свойства слюны играют важную роль в защите организма животного от инфекции. Используемые в ветеринарии фотонефелометрические методы исследования бактерицидной активности разработаны применительно к сыворотке крови, поэтому отдельные методические вопросы реализации их относительно слюны животных на сегодня остаются нерешенными. Так, на величине бактерицидной активности слюны могут сказаться ее неоднородность и вязкость, обусловленные содержанием большого количества муцина, слущенного эпителия ртовой полости, лейкоцитов, микрофлоры и продуктов ее жизнедеятельности, остатков пищи и др.

Вышеизложенное свидетельствует о необходимости исследования бактерицидной активности слюны животных разных видов, а также повышения информативности данного показателя путем минимизации влияния методических факторов на его величину. Целью наших исследований явилось установление влияния преаналитических процедур на величину бактерицидной активности слюны коров и овец.

Материалы и методы. Слюну получали от клинически здоровых нестельных коров черно-пестрой породы в возрасте 4-6 лет массой от 300 до 400 кг (10 голов), содержавшихся на молочно-товарной ферме ООО «Серп и Молот», с. Шапши Высокогорского района РТ, благополучного по инфекционным заболеваниям, а также от овец в возрасте 2-х лет (10 голов) из Казанского зооботсада. Сбор ее проводили после фармакологической активации секреции 1 %-ным раствором пилокарпина гидрохлорида в дозах 15 и 2,5 мл коровам и овцам, соответственно. Собранную слюну сразу замораживали и после размораживания одну ее половину центрифугировали при 3 тыс. об./мин в течение 10 мин, одну часть надосадочной жидкости фильтровали, другую – нет, оставшуюся половину использовали нецентрифугированной. Кровь у животных забирали из яремной вены стерильно специальными системами во флаконы емкостью 250 мл. Сыворотку крови получали по методике Н.И. Гурьянова (1992), центифугировали при 1,5 тыс. об./мин в течение 15 мин и замораживали. После размораживания ее пропускали через мембранные фильтры фирмы «Millipore» диаметром пор 0,22 мкм.

Бактерицидную активность слюны и сыворотки крови определяли по методике О.В. Смирновой, Т.А. Кузьминой (1966), используя в качестве тест-культуры микроорганизмы, относящиеся к разным группам – E.coli (грамотрицательные) в дозе 5 млн. бак. клеток в пробе, B. subtilis и M. lysodeikticus (грамположительные) - 150 и 5 млн. бак. клеток в пробе соответственно. Продолжительность инкубации проб слюны при использовании E.coli и B. subtilis составила 5 ч, M. lysodeikticus – 3 ч. В качестве основы питательной среды использовали гидролизат Хоттингера в количестве 5 мл в пробе.

Результаты исследований. Результаты исследования бактерицидной активности слюны животных представлены в таблице.

Влияние преаналитических процедур на величину бактерицидной активности (%) слюны жвачных животных

Выявлено, что при центрифугировании и фильтровании величина бактерицидной активности слюны повышается с использованием тест-культур E.coli, B. subtilis и M. lysodeikticus у коров в среднем на 15,8 и 28; 10,8 и 24,7; 7,4 и 24; у овец - на 16,7 и 24,9; 9,9 и 23,8; 12,3 и 29 % соответственно. Отмечается высокая вариабельность величины данного показателя у интактной слюны, связанная, вероятно, с наличием в ней большого количества муцина, клеток и других частиц во взвешенном состоянии. При центрифугировании последние оседают. Кроме того, интактная слюна, скорее всего, контаминирована микробами, которые, наряду с кишечной палочкой, приводят к приросту оптической плотности в опытных пробах. Фильтрование слюны позволяет удалить посторонние микробы.

Выводы. Величина бактерицидной активности слюны коров и овец повышается при проведении дополнительных преаналитических процедур: центрифугировании и фильтровании. Отмечается значительная вариабельность величины данного показателя у интактной слюны.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Боровский, Е. В. и др. Биология полости рта / Е. В. Боровский, В. К. Леонтьев – М.: Медицина, 1991.- 304 с. 2. Гурьянов, Н.И. Усовершенствование технологий получения сывороток крови кур, бычков, эмбрионов коров и изучение их свойств при культивировании клеток и вирусов: Автореф. дисс. … канд.биол.наук / Н.И. Гурьянов-Казань, 1992.19 с. 3. Смирнова, О.В. Определение бактерицидной активности сыворотки крови методом фотонефелометрии /О.В.Смирнова, Т.А. Кузьмина //ЖМЭИ.-1966.- № 4.- С. 8-11. 4. Jalil, R. et al. The relationship between 48h dental plaque accumulation in young human adults and the concentrations of hypothiocyanite, ‘free‘ and ‘total‘ lysozyme, lactoferrine and secretory immunoglobulin A in saliva / R. Jalil, F. Ashley, R. Wilson // Arch. Oral Biol.-1992.- V. 37.- P.23–28. 5. Lande, R. et al. Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide / R. Lande, J. Gregorio, V. Facchinetti et al. // Nature.- 2007.- V. 449.- P. 564-569. 6. Lehner, T. Immunology of oral diseases / T. Lehner,- 3rd ed. United Kingdom: Blackwell Scientific Publications, Oxford,1992. 7. Ouhara, K. et al. Susceptibilities of periodontopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells / К. Ouhara, Н. Komatsuzawa, S. Yamada et al. // J. Antimicrob. Chemother.- 2005.- V. 55 .-P. 888 -8 96 . 8. Shugars, D . Endogenous mucosal antiviral factors of the oral cavity / D . Shugars // J. Infect. Dis.- 1999.- V.179.- Suppl. 3 .- P. 431 -43 5 .

ВЛИЯНИЕ ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИХ ПРОЦЕДУР НА ВЕЛИЧИНУ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СЛЮНЫ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

Покровская Е.С., Гильмутдинов Р.Я.Махамат М.К.

Резюме

Установлено влияние преаналитических процедур на величину бактерицидной активности слюны коров и овец. При центрифугировании и фильтровании величина бактерицидности обеих биологических жидкостей увеличивается. У интактной слюны величина данного показателя сильно вариабельна.

THE IMPACT OF PREANALYTICAL PROCEDURES FOR THE BACTERICIDAL ACTIVITY OF SALIVA OF RUMINANT ANIMALS

Pokrovskaya E.S., Guilmutdinov R.Y., Mahamat M.K.