Влияние процесса инкапсуляции на сохранение антиоксидантных свойства флавоноидов

Растительные биологически активные вещества (БАВ) в клинических исследованиях доказали многочисленные фармакологические эффекты для здоровья человека. Многие из них можно использовать для немедикаментозной коррекции неинфекционных заболеваний, таких как сердечно-сосудистые, метаболические заболевания, а также некоторые формы онкологических заболеваний. Однако многие природные БАВ химически нестабильны и подвержены окислительной деградации, что может приводить не только к их разрушению, но и к появлению недопустимых характеристик самого обогащенного продукта и отрицательно повлиять на стабильность продукта при хранении [1–4].

Зачастую применение чистых БАВ (например, флавоноидов) в составе биологически активных добавок или в составе пищевых продуктов весьма ограничено в силу их особенностей, например, низкой растворимости, плохой биодоступности, а также легкого разрушения под действием внешних факторов [5, 6, 10, 11].

По этой причине для обеспечения сохранения положительных свойств биологически активных соединений или улучшения их тех- нологической пригодности для пищевых производств, а также увеличения биодоступности и биоактивности для организма человека требуется разработка новых технологических решений.

Одним из таких решений могут быть технологии инкапсуляции, среди которых мик роинкапсуляция и наноинкапсуляция. П од инкапсуляцией понимают процесс, при котором БАВ защищается материалом носителя при образовании частиц или капсул в микро-метровом или нанометровом масштабе [2].

Технологии инкапсуляции широко применяются в пищевой и фармацевтической промышленности для повышения эффективности полифенолов, микроэлементов, ферментов и др., позволяя создавать защитные барьеры от воздействия света, кислорода, pH, влаги, температурного воздействия и других стрессорных факторов внешней среды. На наш взгляд, микроинкапсуляция и наноинкапсуляция имеют реальные перспективы к масштабированию в промышленных объемах.

Основной задачей инкапсуляции является увеличение биодоступности, контролируемое высвобождение БАВ в организме человека и точность концентрации активного компонента. Поэтому одним из основных факторов успешного процесса инкапсуляции Б АВ является выбор подходящего инкапсулирующего агента. При этом важно учитывать некоторые особенности подбора агентов для инкапсуляции:

• –    с точки зрения безопасности инкапсулирующие агенты должны быть одобрены как биоразлагаемые и безопасные (в странах ЕС «общепризнанные безопасные вещества» имеют маркировку GRAS) материалы для пищевых продуктов;

• –    с точки зрения функциональности инкапсулирующие вещества должны обладать способностью защищать биоактивные соединения при различных условиях обработки;

• –    они должны иметь приемлемые технологические свойства, а это, как правило, низкая вязкость при высокой концентрации, хорошая эмульгирующая способность и растворимость [2, 3–6, 16, 17].

Идеально, если инкапсулирующие вещества способны обеспечить «адресную доставку», преодолевая кислотное и ферментативное состояние желудочно-кишечного тракта, а также увеличить проникающую способность БАВ.

Наиболее широко для инкапсуляции БАВ используются природные биополимеры, среди которых белки, углеводы и жиры. Они, как правило, биоразлагаемы и нетоксичны для организма человека. В частности, из углеводов широко используются полисахариды – крахмал, циклодекстрины, пектины; из белков – желатин, зеин, глиадин, сывороточные белки. Липиды наиболее применимы в технологии получения эмульсий, для которых используются растительные масла и различные поверхностно-активные вещества [1, 2, 4, 9–11].

Среди БАВ антиоксидантного действия достаточно известны и широко используются в качестве антиокислителей в пищевой индустрии таксифолин и рутин. При размещении в систему пищевого продукта данные вещества могут значительно утрачивать свои свойства и не проявлять в полной мере свои технологические функции.

Целью настоящего исследования стала разработка инкапсулированных комплексов таксифолина и рутина с применение технологии конъюгации (с использованием β-цикло-декстрина) и коацервации (с применением желатина и пектина) и оценка влияния технологии инкапсуляции на сохранение свойства биологически активного вещества.

Материалы и методы

В рамках настоящего исследования в качестве БАВ были выбраны флавоноиды – рутин и таксифолин, как наиболее изученные растительные антиоксиданты, перспективные для использования в качестве функциональных пищевых ингредиентов при производстве функциональных, обогащенных и специализированных пищевых продуктов. Общая характеристика и молекулярная структура которых представлены на рис. 1 и в таблице соответственно.

Рутин (кверцетин-3-рутинозид (3', 4', 5, 7-тетрагидроксифлавон-3β- d- рутинозид)) представляет собой фенольное соединение с хорошо изученным терапевтическим потенциалом и высокой степенью безопасности. Рутин обладает рядом потенциально полезных эффектов для организма человека, среди которых антирадикальное действие, противовоспалительное, противоопухолевое действие и свойства укрепления кровеносных капилляров [12].

Таксифолин – это флаванонол, который занимает лидирующие позиции среди известных антиоксидантов, включая витамины С, Е и

β-каротин, превосходя их по шкале ORAC. За последние несколько десятилетий таксифолин достаточно интенсивно изучался благодаря уникальным плейотропным биологическим свойствам. Для него установлены такие фармакологические эффекты как противовосполи-тельное действие, гепатопротекторное, капилляропротекторное, антиоксидантное, дезин-токсикационное и др. Как часть фенольных соединений таксифолин был обнаружен во многих растениях, различных ягодах, фруктах, овощах, пищевых маслах, орехах, лекарственных травах и растениях [1, 2, 10, 11].

Физико-химические свойства рутина и таксифолина [7]

Свойство	Значение
	Рутин	Таксифо-лин
Растворимость в воде, г/л	12,8	1,16
log P	–0,54	1,07
Физиологический заряд	–1	0
Количество акцепторов водорода	21	7
Количество доноров водорода	13	5
Площадь полярной поверхности, Å2	344,67	127,45
Преломление, м³·моль–1	172,56	74,61
Поляризуемость, Å3	73,13	29,03
Количество бензойных колец	6	3

Объектами исследования были определены порошкообразные формы флавоноидов:

таксифолин , изготовитель ООО «Такси-фолия», Белгород. Свидетельство о государственной регистрации № RU 77.99.003 Е.018404.05.11 от 6 мая 2011 г. Чистота 98– 99 %;

рутин , изготовитель Now Foods (США), источник – цветы Сафоры японской).

В качестве вспомогательных веществ для инкапсуляции использовали:

β-циклодекстрин (βCD) пищевой (Е459), был приобретен в ООО «Кемикал Лайн», использовали для инкапсуляции таксифолина;

желатин    говяжий,    изготовитель

пектин цитрусовый, изготовитель Valde.

а)

б)

Рис. 1. Пространственная структура молекул рутина (а) и таксифолина (б) [7]

Условия инкапсуляции

Инкапсуляцию таксифолина в βCD проводили при соотношении компонентов 3:1 по молярной массе. Навески соответствующих количеств таксифолина и βCD растворяли в установленном количестве растворителя (40 % водно-этанольный раствор) и вымешивали при скорости 200 об/мин в течение 3 ч при температуре 40 °С.

Инкапсуляцию рутина проводили путем его внесения в установленном количестве в предварительно подготовленный водный раствор желатина (2 мас. %/об.) в условиях механического перемешивания при скорости 500 об/мин в течение 15 мин. Затем в полученную суспензию был внесен водный раствор пектина (2 мас. %/об.) и созданы условия для коацервации путем изменения значения рН с применением 0,5н раствора HCl.

Методы исследования

Полученные в ходе инкапсуляции суспензии таксифолина и рутина оценивали в сопоставлении с исходным видом, по следующим показателям при использовании описанных методов:

Морфология инкапсулированных комплексов изучалась путем приготовления неокра- шенных препаратов раздавленная капля с использованием просвечивающей микроскопии при увеличении *640.

Общая антиоксидантная (антиради-кальная) активность определялась методом DPPH (%) по модификации [14]. Использовали метанольный раствор DPPH 60 мкМ, 1 мл которого смешивали с 1 мл исследуемого раствора, инкубировали в темноте в течение 30 мин. Поглощение измеряли спектрофотометрически при 515 нм.

АОА рассчитывали по формуле:

2-я фаза - фаза тонкого кишечника (рН 6,5-7, ферменты панкреатин и липаза, температура 37 °C, 2 ч), затем смесь центрифугируется (8000 об/мин, 10 мин), фильтруется через мембранный ацетат-целлюлозный фильтр (0,45 мкм).

В полученном фильтрате определяется количество ДГК и АОА (DPPH, %).

Индекс биоактивности (ИБА, %), рассчитываемый по формуле:

И БА =

ЛПЛ ¹ - ( ^D i - ^D j )

АОА =------- j—

^АОАконц АОА исх

Х 100,

D c

х 100,

где D i - оптическая плотность исследуемого раствора; D j - оптическая плотность контрольного раствора DPPH с метанолом; D c -оптическая плотность раствора DPPH.

Потенциальная биоактивность - на основе определения индекса биоактивности (ИБА) по методике [13].

Использование моделирования процесса переваривания in vitro проходило последовательно в две фазы:

где АОАконц - АОА (DPPH, %) БАВ после процесса переваривания in vitro ; АОАисх -АОА (DPPH, %) БАВ в исследуемом растворе

до процесса переваривания.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования морфологических характеристик (рис. 2) исходных форм флавоноидов - таксифолина и рутина и их инкапсулированных комплексов показывают, что технологии инкапсуляции в значительной степени изменяет морфологию БАВ. Если исходные формы флавоноидов представляют собой кристаллы неправильной формы и раз-

Рис. 2. Результаты микроскопии флавоноидов (препарат – раздавленная капля, увеличение х640 ): исходных форм (а – таксифолин; б – рутин) и инкапсулированных комплексов (в – таксифолин-βCD; г – коацерват рутина)

ного размера (см. рис. 2а и 2б), то после проведения инкапсуляции (см. рис. 2в и 2г) четко видны комплексы включения флавоноидов в соответствующую «систему доставки».

Вместе с тем, для оценки эффективности выбранных технологий инкапсуляции необходима оценка их влияния на биологическую активность БАВ. Поэтому в рамках настоящих исследований была предпринята попытка изучить роль технологий инкапсуляции для сохранении антиоксидантных свойств флавоноидов в процессе их пищеварения.

Исследования показали, что процесс инкапсуляции оказывает влияние на антиоксидантные свойства БАВ (рис. 3). Значения показателя общей АОА (DPPH, %) инкапсулированного таксифолина снизились на 19,3 % по отношению к исходному образцу. Это может быть объяснено экранировкой части OH-групп таксифолина при формировании конъюгата, которые не приняли участия в реализации антиоксидантного эффекта.

Ранее проведенные исследования показали, что наиболее вероятным при формировании конъюгатов таксифолина и βCD является взаимодействие, экранирующее две OH-группы фенильного заместителя таксифолина [1, 2, 10, 11].

Снижение АОА для рутина, инкапсулированного методом коацервации, составило 55,4 % по отношению к АОА исходного рутина. Данные результаты могут быть обусловлены тем, что комплексная защитная оболочка из желатина и пектина при коацервации полностью покрывает биологически активное вещество, не позволяя ему вступать в реакцию с DPPH-реактивом. АОА коацервата (30,2 %), вероятно, сформирована за счет рутина, оставшегося неинкапсулированным. Согласно имеющихся в литературе данных, эффективность инкапсуляции при использовании комплексной коацервации составляет в среднем 60–80 % и в значительной степени зависит от правильно подобранных условий проведения процесса инкапсуляции, в первую очередь, значений рН.

На следующем этапе исследований была определена потенциальная биодоступность исходных флавоноидов и их инкапсулированных комплексов с использованием модели переваривания in vitro . Результаты определения индексов биоактивности представлены на рис. 4.

Рассматривая процессы инкапсуляции с точки зрения их влияния на биологические эффекты образующихся комплексов, большинство исследований доказывают, что технологии инкапсуляции способствует сохранности флавоноидов в процессе пищеварения, обеспечивая более эффективную их доставку в организм человека. Согласно данным литературы снижение антиоксидантной активности в результате in vitro переваривания в первую очередь зависит от класса фенольного соединения, его устойчивости к воздействию рН, ферментов и склонности к структурным превращениям, которые приводят к метаболитам с различными химическими свойствами и, как правило, с более низкой биоактивностью [5, 6, 9, 15].

Проведенные авторами научные исследования показали, что после процедуры переваривания in vitro потенциальная биоактивность (выраженная индексом биоактивности) исходных форм флавоноидов снизилась на 51,2 и 41,5 % для таксифолина и рутина соответственно. Вместе с тем, инкапсуляция таксифо-лина в βCD позволила в значительной степени обеспечить сохранность антиоксидантных свойств БАВ, И БА составил 72,4 %. Наибольшую же эффективность с точки зрения сохранения потенциальной биоактивности показала технология коацервации, которая позволила обеспечить значения И_БА для рутина более 80 %, а значит предотвратить процессы окислительной деградации БАВ при пищеварении, снизить уровень его атакуемости ферментами. Это, в свою очередь, обеспечивает большее остаточное количество действующего вещества после процедуры переваривания в модели in vitro , что согласуется и с результатами исследований, представленными в доступной литературе [4, 12, 16, 17].

Заключение

Таким образом, представленные материалы и исследования продемонстрировали эффективность и целесообразность использования подходов получения конъюгатов таксифо-лина и коацерватов рутина для обеспечения сохранности антиоксидантных свойств данных флавоноидов и возможность более эффективной их доставки в системы организма человека.

Несмотря на неспособность модели переваривания in vitro полностью имитировать физиологические условия, возникающие при реальном пищеварении человека, такие модели целесообразно использовать в качестве прогностической оценки биоактивности как от-

Рис. 3. АОА (DPPH, %) водных растворов (0,01 %) исходных и инкапсулированных флавоноидов

Рис. 4. Потенциальная биоактивность водных растворов (0,01 %) исходных и инкапсулированных флавоноидов (И БА )

дельных пищевых ингредиентов, так и готовых пищевых продуктов [8].

Вместе с тем, для оценки эффективности рассматриваемых подходов инкапсуляции требуется расширение исследований, в том числе в направлении оценки уровня загрузки капсульных систем, их дисперсного состава, влияния технологий инкапсуляции на уровень биодоступности БАВ и т. д.

Статья выполнена при поддержке Правительства РФ (Постановление № 211 от 16.03.2013 г.), соглашение № 02.A03.21.0011, при финансовой поддержке гранта Президента РФ для молодых ученых для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук МК-3690.2021.5.