Влияние прогестерона и кортизола на показатели гемостаза в организме телок голштино-фризской породы

Процессы гемостаза довольно широко изучались в гуманной медицине в последние несколько десятилетий, что связано с ростом заболеваний, сопровождающихся тромбозом сосудов [15]. В ветеринарной медицине данные исследования малочисленны [1, 4].

Установлено, что функции и физиология клеток крови регулируется, как физико-биологически, так и эндокринно. При этом эндокринные механизмы определяют реакцию клеток крови на изменение свойств среды за счет контроля экспрессии соответствующих генов, функционирования сигнальных путей и модификации архитектуры цитоскелета [15].

Клеточным элементом системы гемостаза являются тромбоциты, участвующие в образовании сгустка совместно с растворимыми факторами свертывания крови и контролирующие целостность кровеносных сосудов. Однако они участвуют также в регуляции ряда физиологических процессов, так как служат источником ряда биомолекул (факторы роста, адгезивные молекулы, цитокинины) [10] и имеют мембранные рецепторы, как и другие клетки, при помощи которых получают информацию о состоянии окружающей их среды. По данным [15], структурные изменения клеток в популяции тромбоцитов крови являются результатом «сигнальных каскадов», происходящих на молекулярном уровне. Например, эффект гликопротеиновых рецепторов на поверхности тромбоцитов и их способность взаимодействовать с растворимыми белками, высвобождаемыми активированными тромбоцитами и циркулирующими в крови, позволяет клетками создавать силы адгезии и агрегации [14]. Система гемостаза и циркулирующие тромбоциты чувствительны к действию серотонина, тромбоксана А2 и аденозиндифосфата [15], прогестерона и тестостерона [8], гормонов гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой оси [7]. При этом гормоны гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси обеспечивают адаптивные изменения в системе гемостаза при воздействии эндо- и экзогенных факторов. В частности, кортизол повышает продукцию, активацию и агрегацию тромбоцитов [13].

В связи с вышесказанным, целью данной работы явилась оценка роли кортизола и прогестерона в вариабельности параметров тромбоцитарного гемостаза у телок голштино-фризской породы в фазу растительного питания.

Материал и методы исследований.

Исследовательская часть работы выполнена в 2020-2021 гг в условиях ТОО «Белагаш» (Республика Казахстан). Одним из приоритетных направлений сельскохозяйственного предприятия является молочное животноводство, основанное на использовании продуктивного потенциала голштино-фризкой породы, завезенной в 2011 г из США. В молочный период кормления телочки содержатся в отделении для новорожденных. Затем переводятся в отделение выращивания, включающее секцию доращивания (2-7 мес.) и секцию для случки (от 7 мес. возраста). Способ содержания беспривязный боксовый, кормление двухкратное. Телок кормят концентрированной кормосмесью, сеном и витаминными гранулами, а, начиная с 4месячного возраста, добавляют сочные корма. Рационы кормления животных соответствуют нормам ВИЖ.

Для проведения исследований была сформирована опытная группа по принципу приближенных аналогов из телочек 3-месячного возраста (n=10), у которых в 3-, 6-, 9-, 12-, 15-месячном возрасте брали кровь утром до кормления вакуумным методом из хвостовой вены, используя вакуум-содержащую систему. Образцы крови собирали в вакуумные пробирки (VACUETTE), предназначенные для гематологических (фиолетовая крышка) и биохимических исследований (красная крышка).

Лабораторные исследований выполнены в ТОО «Лаборатория ИВ Смолина» (г. Костанай) в первые сутки после её взятия при помощи автоматического гематологического анализатора «Sysmex, XS-500I» (Япония), иммуноферментного микропланшетного автоматического анализатора Infinite F50, HydroFlex Washer Software (Tecan Austria GMBH).

Статистический анализ предусматривал расчет среднего значения (Х) и его стандартной ошибки (Sx). Меру сходства признаков определяли при помощи коэффициента корреляции Спирмена. Статистическую значимость связей принимали равной Р≤0,05.

Результат исследований. Важную роль в формировании физиологического статуса организма играет циркуляция крови в кровеносной системе с определенной степенью вязкости [6]. При этом скорость кровотока сопряжена с количеством тромбоцитов, являющихся частью системы гемостаза и определяющих в крови так называемый «первичный гемостаз» при повреждении кровеносных сосудов.

Уровень кровяных пластинок (Таблица 1) в крови телок голштино-фризской породы в ходе роста и развития их организма с 3-го по 15-месячный возраст увеличивался с 294,30±4,31 до 441,70±5,22 109/л (р≤0,05), как результат изменения количества крови в кровеносной системе. Как известно, тромбоциты в крови циркулируют вдоль стенки кровеносных сосудов, не прилипая к её структурам [6], что сопряжено с морфологическими характеристиками клеток [1, 5].

О морфологических свойствах тромбоцитов можно судить по величине следующих параметров:

1.Тромбокрит – отражает общую объемную долю тромбоцитов в составе крови. Данный параметр в крови телок опытной группы с возрастом увеличивался и колебался в интервале 0,18±0,01 – 0,29±0,01 % (Таблица 1). Минимальный уровень тромбокрита выявлен в организме 3-месячных телок, максимальный – 9месячных. Хотелось бы обратить внимание на то, что отсутствовала пропорциональность между возрастной изменчивостью количества тромбоцитов и величиной тромбокрита. Следовательно, красные пластинки изменяли свои морфологические характеристики в зависимости от условий окружающей среды, и они не были «строго сопряжены» с возрастом животных. Данный вывод согласуется с данными [9], согласно которым размерные характеристики тромбоцитов взаимосвязаны с их специализированными функциями, востребованность которых определяет соотношение между субпопуляциями клеток в кровеносном русле.

• 2.    Средний объем тромбоцитов – характеризует размер и возраст клеток в кровотоке. Величина параметра с возрастом увеличивалась с 6,20±0,03 до 7,70±0,13 фл., но его изменчивость не была «строго» взаимосвязана с возрастом телок, как и тромбокрита. Максимум параметра отмечен у телок в 9-месячном возрасте, минимум – в 3-месячном.

• 3.    Показатель анизоцитоза тромбоцитов – отражает гетерогенность клеток в кровеносном русле по объему. Возрастная изменчивость данного параметра была аналогична вариабельности тромбокрита и среднего объёма тромбоцитов, то есть имела тенденцию к повышению в ходе роста и развития организма телок при максимуме параметра в 9-месячном возрасте, отражая изменчивость активности кровяных пластинок в кровотоке.

• 4.    Количество мегалотромбоцитов – характеризует долю «молодых» клеток в популяции тромбоцитов крови, которые обладают наибольшей агрегационной способностью [9]. Число мегалотромбоцитов в крови телок с возрастом увеличивалось с 3,52±0,0 до 7,70±0,03 %. При этом наибольший уровень

По данным [11], размер тромбоцитов сопряжен с их возрастом: молодые клетки имеют больший размер, чем «старые», циркулирующие в крови в течение нескольких дней. В тоже время в работе [9] отмечено, что не возраст клеток влияет на размер тромбоцитов, а особенности тромбопоэза. Поэтому логично предположить, что возрастные особенности роста и развития телок в период их выращивания определяют «оборот клеток» в кровеносной системе.

«больших клеток» выявлен в анализах 9-месячных телочек. По данным [9], их количество сопряжено со степенью гетерогенности мегакариоцитов, продуцирующих тромбоциты разного размера и плотности.

Таким образом, в крови телок в растительный период их выращивания увеличивалось количество тромбоцитов. Однако их морфологические свойства, оцениваемые по величине тромбокрита, среднего объема клеток, показателю анизоцитоза и количеству мегалотромбоцитов, были сопряжены с пролиферативной активностью костного мозга и скоростью «оборота клеток» в кровеносном русле. При этом возраст телок – 9 месяцев, в который отмечен максимум величин морфологических характеристик тромбоцитов, является «критическим» в становлении тромбопоэза и системы гемостаза в организме растущих животных.

Таблица 1 – Тромбоциты и их характеристики (n=10)

Показатель		Возраст телок, мес
		3	6	9	12	15
Тромбоциты, 109/л	Х	294,30	305,30*	351,30*	391,30*	441,70*
	Sx	4,31	2,20	9,17	12,81	5,22
Тромбокрит, %	Х	0,18	0,21	0,29	0,25*	0,22*
	Sx	0,01	0,01	0,01	0,02	0,04
Средний объем тромбоцитов, фл	Х	6,20	6,50	7,70*	7,57*	7,20*
	Sx	0,03	0,05	0,13	0,05	0,03
Показатель анизоцитоза тромбоцитов, %	Х	6,73	6,80	9,60*	8,50*	7,33*
	Sx	0,04	0,03	0,03	0,05	0,04
Количество мегалотромбоцитов, %	Х	3,52	3,76	7,70*	7,47*	6,76
	Sx	0,04	0,04	0,03	0,48	0,16

Примечание: * – Р≤0,05 по отношению к возрасту 3 мес.

Таблица 2 – Возрастная вариабельность прогестерона и кортизола в крови телок (n=10)

Показатель		Возраст телок, мес
		3	6	9	12	15
Кортизол, нмоль/л	Х	5,63	7,13*	12,90*	46,40*	44,80*
	Sx	0,42	0,18	0,36	4,52	2,40
Прогестерон, нмоль/л	Х	0,16	0,27*	0,34*	3,16*	7,37*
	Sx	0,02	0,03	0,05	0,08	0,68
Прогестерон / Кортизол, усл. ед.	Х	0,028	0,038	0,026	0,068	0,16*
	Sx	0,004	0,004	0,004	0,01*	0,08

Примечание: * - Р≤0,05 по отношению к возрасту 3 мес

По данным [9], свойства клеток в популяции тромбоцитов кровеносного русла сопряжены с их биохимическими различиями, определяющими способность клеток к восприятию и передаче информации от сигнальных путей. Поэтому мы попытались оценить роль прогестерона и кортизола в регуляции тромбоцитарного звена гемостаза в организме растущих телок. При этом мы исходили из того, что данные стероидные гормоны за счет геномных и не геномных биологических эффектов регулируют метаболический статус клеток органов кроветворения и крови.

Изменчивость концентраций гормонов в крови телок наименьшей вариабельностью отличалась с 3-го по 9-ый месяцы растительного периода выращивания. При этом уровень прогестерона возрастал с 0,16±0,02 до 0,34±0,05 нмоль/л, кортизола с 5,63±0,42 до 12,90±0,36 нмоль/л (Таблица 2). Начиная с 9-месячного возраста, то есть после полового созревания организма телок, как результат повышения востребованности гормонов в регуляции репродуктивных функций в организме животных, их содержание в крови резко возрастало. Так, количество кортизола у 15-месячных телок, по сравнению с 9-месячными, увеличилось в 3,47 раза, а прогестерона - в 21,67 раза (Р<0,05).

Основываясь на том, что прогестерон является субстратом в биохимической цепи образования кортизола [3, 5], мы рассчитали величину соотношения Прогестерон / Кортизол, отражающую долю прогестерона, превращающего в ходе стероидогенеза в кортизол. Так, с 3-го по 9-месяцы растительного периода выращивания биохимическая востребованность прогестерона в синтезе кортизола была минимальная, величина соотношения между гормонами составляла 0,0260,038 усл. ед. Начиная с 9-месячного возраста резко увеличивалась доля прогестерона, подвергающегося распаду (через 17-ОН-прогестерон) до кортизола, так как значение Прогестерон / Кортизол составляло 0,068-0,16 усл. ед.

Мы уже отмечали, что прогестерон и кортизол обладают широким спектром биологических эффектов [3, 5]. Их влияние на систему гемостаза подтверждается развитием гемодинамических нарушений при их использовании [2].

Таблица 3 - Корреляционные связи тромбоцитов и гормонов (прогестерон, кортизол) (n=10)

Показатель		Возраст телок, мес
		3	6	9	12	15
Тромбоциты, 109/л	Прогестерон, нмоль/л	0,06±0,35	0,04±0,35	0,34±0,33	0,72±0,23*	0,92±0,08*
	Кортизол, нмоль/л	0,74±0,23*	0,97±0,08*	0,83±0,19*	0,22±0,23	0,05±0,35
Тромбокрит, %	Прогестерон, нмоль/л	-0,08±0,35	-0,09±0,35	0,36±0,32	0,93±0,13*	0,90±0,14*
	Кортизол, нмоль/л	0,53±0,32	0,54±0,30	0,26±0,34	0,59±0,29	0,20±0,35
Средний объем тромбоцитов, фл	Прогестерон, нмоль/л	-0,11±0,35	-0,20±0,35	-0,48±0,30	0,74±0,23*	0,67±0,29
	Кортизол, нмоль/л	-0,45±0,32	-0,43±0,32	-0,39±0,33	-0,13±0,35	-0,55±0,29
Показатель анизоцитоза тромбоцитов, %	Прогестерон, нмоль/л	0,19±0,35	0,17±0,35	-0,61±0,28	-0,57±0,29	-0,11±0,35
	Кортизол, нмоль/л	-0,50±0,31	-0,59±0,30	-0,60±0,28	-0,15±0,35	-0,17±0,35
Количество мегалотромбоцит ов, %	Прогестерон, нмоль/л	-0,21±0,35	-0,16±0,35	0,89±0,16*	-0,90±0,15*	-0,95±0,11*
	Кортизол, нмоль/л	-0,77±0,22*	-0,78±0,21*	-0,89±0,17*	-0,46±0,31	-0,11±0,35

Примечание: * - Р<0,05

Оценка корреляционных связей      особенности (Таблица 3). Статистически между признаками выявила следующие     значимые корреляции между гормонами и

тромбоцитарными параметрами зависели от возраста телок. В период выращивания с 3-го по 9-месяцы достоверные корреляции выявлены только в парах с кортизолом. При этом уровень гормона был взаимосвязан с количеством тромбоцитов (r=0,74±0,23 – 0,97±0,08) и долей в их популяции мегалотромбоцитов (r=-0,77±0,22 – -0,89±0,17). Начиная с 9-месячного возраста, роль кортизола в регуляции тромбоцитарного звена гемостаза снижалась, но повышалась прогестерона, с которым выявлялись статистически значимые связи в парах признаков. Концентрация прогестерона достоверно коррелировала с количеством тромбоцитов (r=0,72±0,23 – 0,92±0,08), тромбокрита (r=0,90±0,14 – 0,93±0,13) и мегалотромбоцитов (r=-0,90±0,15 – -0,95±0,11).

Основываясь на том, что экспрессия поверхностных рецепторов у тромбоцитов зависит от их активности [12], можно предположить: «Роль прогестерона и кортизола в регулировании активности тромбоцитарного звена гемостаза взаимосвязана с формированием функциональной активности репродуктивной системы в ходе выращивания телок».

Заключение. Вариабельность показателей тромбоцитарного звена гемостаза в организме телок голштино-фризской породы зависит от возраста и функционального состояния физиологических систем. Количество тромбоцитов с 3-го по 15-месячный возраст увеличивается в 1,50 раза (Р≤0,05), но их динамика не согласуется с увеличением уровня тромбокрита и морфологических характеристик клеток. Хотя их величина с возрастом повышается, но максимальный уровень тромбокрита, мегалотромбоцитов, среднего объема тромбоцитов и показателя анизоцитоза отмечен у телок в возрасте 9 месяцев, который можно отнести к «критическому» в становлении системы гемостаза в организме растущих животных. Концентрация прогестерона и кортизола в крови телок наименьшей вариабельностью отличается с 3-го по 9-ый месяцы выращивания, возрастая в 2,13 и 2,29 раза, соответственно. Начиная с 9-го по 15месячный возраст их количество увеличивается в 3,47 и 21,67 раза (Р≤0,05), по сравнению с уровнем 9-месячных телок. Величина соотношения Прогестерон и Кортизол с 3-го по 9-месяцы растительного периода выращивания составляет 0,0260,038 усл. ед., повышаясь с 9-месячного возраста до 0,068-0,16 усл. ед. С 3-го по 9-месяцы выращивания телок статистически значимые корреляции выявлены только в парах с кортизолом: Кортизол-Тромбоциты (r=0,74±0,23 – 0,97±0,08), Кортизол-Мегалотромбоциты (r=-0,77±0,22 – -0,89±0,17). Начиная с 9-месячного возраста достоверно коррелирует прогестерон с количеством тромбоцитов (r=0,72±0,23 – 0,92±0,08), тромбокрита (r=0,90±0,14 – 0,93±0,13) и мегалотромбоцитов (r=-0,90±0,15 – -0,95±0,11).

Резюме

Дана оценка роли кортизола и прогестерона в вариабельности параметров тромбоцитарного гемостаза у телок голштино-фризской породы в фазу растительного питания. Установлено, что количество тромбоцитов с 3-го по 15-месячный возраст увеличивается в 1,50 раза (Р≤0,05), но их динамика не согласуется с тромбоцитарными показателями. Хотя их величина с возрастом увеличивается, но максимальный уровень тромбокрита, мегалотромбоцитов, среднего объема тромбоцитов и показателя анизоцитоза отмечен у телок в возрасте 9 месяцев - «критический возраст» в становлении системы гемостаза. Уровень прогестерона и кортизола в крови телок с 3-го по 9-ый месяцы выращивания возрастает в 2,13 и 2,29 раза, а с 9-го по 15-ый месяцы в 3,47 и 21,67 раза (Р≤0,05) соответственно. Величина соотношения Прогестерон к Кортизолу с 3-го по 9-месяцы растительного периода выращивания составляет 0,026-0,038 усл. ед., повышаясь с 9-месячного возраста до 0,068-0,16 усл. ед. С 3-го по 9-месяцы выращивания телок статистически значимые корреляции выявлены только в парах с кортизолом: Кортизол - Тромбоциты (r=0,74±0,23 – 0,97±0,08), Кортизол - Мегалотромбоциты (r=-0,77±0,22 – -0,89±0,17). Начиная с 9-месячного возраста прогестерон достоверно коррелирует с количеством тромбоцитов (r=0,72±0,23 – 0,92±0,08), тромбокрита (r=0,90±0,14 – 0,93±0,13) и мегалотромбоцитов (r=-0,90±0,15 – -0,95±0,11).