Влияние психротолерантных штаммов бактерий-антагонистов UOZK2 и UOZK7 на структуру бактериального сообщества в ризосфере яровой пшеницы

Введение. Рост интенсивности загрязнения окружающей среды в результате применения химических пестицидов послужил мощным стимулом внедрения биологического метода в практику защиты растений во всех странах мира [6–8, 10, 11]. Исследования показали, что психрофильные и психротолерантные бактерии, выделенные из карстовых пещер, могут использоваться в качестве биопрепаратов для защиты зерновых культур от корневой гнили и листовой пятнистости в Сибири и других регионах с аналогичным климатом. Кроме этого, благодаря своим температурным пределам роста, они не могут развиваться при температуре человеческого тела [2, 5]. Использование данных штаммов бактерий может приводить к изменениям в естественном ризосферном микробном комплексе, что требует дополнительного изучения [9].

Цель работы. Изучение влияния психротолерантных штаммов бактерий UOZK2 и UOZK7 на структуру ризосферного бактериального комплекса яровой пшеницы сорта «Новосибирская 29».

Объекты и методы. В работе использованы следующие штаммы: UOZK2, место выделения – пещера Женевская, максимальная температура роста +26ºС. По результатам секвенирования гена 16S рРНК – 99,1 %-й уровень сходства с Sporosarcina globispora DSM 4 (T) X68415; UOZK7, место выделения – пещера Женевская, максимальная температура роста +29ºС, предварительная идентификация – Bacillus sp. Штаммы были выделены Е.П. Ланкиной и С.В. Хижняком и в ходе лабораторных испытаний показали высокую антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов р. Bipolaris , Alternaria и Fusarium [2].

Микрополевой опыт проводили в 2013 году на полевом стационаре Красноярского государственного аграрного университета с использованием предоставленных Красноярским НИИ сельского хозяйства Рос-сельхозакадемии семян яровой пшеницы Новосибирская 29. Природная зона – Красноярская лесостепь. Климат – умеренно сухой и континентальный (мера континентальности 61–63 %, или 189, по Иванову Н.Н.). Почва представлена черноземом выщелоченным среднегумусным среднесуглинистым, с очень высоким содержанием подвижного фосфора (26 мг/100 г) и обменного калия (22 мг/100 г). Гидротермический режим вегетационного периода 2013 года существенно отличался от среднемноголетних характеристик. ГТК Селянинова с мая до сентября составил 2,0. Опыт проводился в сосудах без дна площадью 0,1 м2, повторность шестикратная. Схема опыта: 1. Контроль (семена пшеницы Новосибирская 29 без обработки). 2. Бактеризация семян суспензией клеток UOZK2. 3. Бактеризация семян суспензией клеток UOZK7. Бактеризация осуществлялась из расчёта 10 л суспензии на 1 т семян, титр суспензий составлял 1×109 клеток/мл.

Для анализа ризосферной микрофлоры использовали смывы с корней. Для этого в фазу всходов, кущения и колошения отбирали по 5 растений из каждой повторности (всего по 30 растений на вариант опыта в каждую фазу). Из отобранных растений формировали объединённую пробу. Для микробиологического анализа производили смыв с корней объединённой пробы стерильной водой, после чего осуществляли глубинные посевы из смыва с использованием микропипет-дозатора в набор питательных сред (по 2 мкл в каждую питательную среду). Численность аммонифицирующих микроорганизмов (АМ) учитывали на ПД-агаре. Численность азотфиксирующих и олигонитрофильных микроорганизмов (ОЛН) учитывали на среде Эшби. Численность гетеротрофных микроорганизмов, использующих минеральные формы азота (ГМ), учитывали на среде Чапека. Численность олиготрофных микроорганизмов (ОЛГ) учитывали на среде, содержащей 50 мл/л ПД-агара, 50 мл/л среды Чапека и 20 г/л агара [4]. Численность микроорганизмов каждой из упомянутых эколого-трофических групп определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ). В качестве показателя олиготрофности использовали отношение ОЛГ/АМ, в качестве показателя олигонитрофильности – отношение ОЛН/АМ, в качестве показателя минерализации – отношение ГМ/АМ [1]. Статистический анализ влияния обработки изучаемыми штаммами на относительную численность микроорганизмов основных экологотрофических групп (КОЕ на чашку Петри) в ризосфере на изучаемых стадиях оценивали по критерию χ2 [3]. В качестве программного обеспечения использовали средства MS Office XP и StatSoft STATISTICA 6.0.

Результаты и их обсуждение. Проведенные исследования показали, что бактеризация семян штаммами UOZK2 и UOZK7 привела к статистически значимым (p<0,001) изменениям в структуре ризосферного бактериального сообщества на стадиях всходов, кущения и колошения. Это проявилось в изменениях относительных численностей аммонифицирующих микроорганизмов, азотфиксирующих и олигонитрофильных микроорганизмов, гетеротрофных микроорганизмов, использующих минеральные формы азота, и олиготрофных микроорганизмов в сравнении с контролем.

Так, динамика олиготрофности ризосферных бактериальных комплексов в вариантах с бактеризацией штаммами UOZK2 и UOZK7 показала, что ее рост особенно ярко проявился к моменту кущения (рис. 1).

- ♦ - Контроль

—■— UOZK2

—£- UOZK7

Рис. 1. Динамика показателя олиготрофности ризосферных бактериальных комплексов в разных вариантах эксперимента

Олигонитрофильность ризосферных бактериальных комплексов в варианте с бактеризацией штаммом UOZK2 выросла к фазе кущения. А в варианте с бактеризацией штаммами UOZK7 к моменту колошения (рис. 2).

- ♦ - контроль

—■— UOZK2

-Л- UOZK7

Всходы        Кущение Колошение

Рис. 2. Динамика показателя олигонитрофильности ризосферных бактериальных комплексов в разных вариантах эксперимента

Что касается показателя минерализации, то в данном случае максимальный стимулирующий эффект оказала бактеризация штаммом UOZK2 (рис. 3).

0,6

0,5

- ♦ - контроль

—■— UOZK2

—Л- UOZK7

0,4

0,3

0,2

0,1

Всходы        Кущение      Колошение

Рис. 3. Динамика показателя минерализации ризосферных бактериальных комплексов в разных вариантах эксперимента

Таким образом, бактеризация во всех вариантах привела к росту олиготрофности и олигонитрофиль-ности ризосферных комплексов, этот рост особенно ярко проявился к моменту кущения и колошения.

Выводы

• 1.    Указанные изменения в ризосферном микробном комплексе свидетельствуют о том, что изучаемые штаммы успешно интродуцировались в ризосферу и сохраняли свою биологическую активность в течение всего изучаемого периода.

• 2.    Можно констатировать, что бактеризация в большинстве вариантов привела к существенному росту олиготрофности, олигонитрофильности и показателя минерализации в ризосфере. В качестве объяснения наблюдаемого эффекта можно предположить стимуляцию процессов изъятия ризосферной микробиотой органического углерода и органического азота, выделяемого корнями пшеницы.