Влияние различных рационов кормления на ассоциацию полиморфизма в гене MSTN и роста живой массы у молодняка петушков пушкинской породы

Изучение полиморфизма генов, влияющих на рост и развитие сельскохозяйственной птицы, является важным направлением современной генетики. Мясо кур составляет существенную долю в ежедневном рационе современного человека, поскольку является источников необходимых белков, аминокислот, микроэлементов и витаминов.

В последнее время актуальны исследования, направленные на поиск взаимосвязей между полиморфизмами отдельных генов, отвечающих за развитие мышечной и костной массы, и продуктивными характеристиками кур.

Ген миостатина у высших позвоночных способствует выработке одноименного белка, который, в свою очередь, оказывает отрицательное влияние на развитие мускулатуры [1]. Если путь от гена MSTN к мышцам блокируется, происходит их усиленный рост. Мутации, приводящие к изменениям последовательности ДНК в различных участках гена MSTN, встречаются у ряда животных. У высших позвоночных MSTN тканеспецифичен, его синтез происходит в скелетных мышцах, на которые он и оказывает биологические эффекты [2, 3].

Нуклеотидная последовательность гена миостатина полностью прочитана, а также известно, что этот ген включает в себя три экзона и два интрона [4]. Сейчас особое внимание уделяется обнаружению однонуклеотидных замен (SNP) в смысловых участках миостатинового гена, для того чтобы выявить их ассоциации с признаками продуктивности [5, 6].

Целью нашей работы было определить ассоциацию типа кормления со скоростью роста петушков пушкинской породы в зависимости от генотипа по замене rs313744840 в гене миостатина.

Материал и методы исследования

В качестве материала для исследования послужила ДНК, которая была выделена в крови петушков фенольным методом с использованием протеиназы К.

Каждый цыпленок при рождении был помечен индивидуальной меткой. В зависимости от типа кормления были сформированы 2 группы птицы. Первая (n=52) выращивалась на корме, предназначенном для откорма бройлерного молодняка (корм ПК-5, производство Тосненского комбикормового завода) до возраста 63 дня. Вторая группа (n=46) росла на корме для молодняка кур-несушек (ПК-4, производство ТККЗ). И тот и другой комбикорм являются полнорационными кормами. В корме ПК-5 отмечено повышенное содержание протеина (до 20%) и обменной энергии (до 310 ккал в 100 г корма).

Для определения живой массы петушков взвешивали на весах марки «Гос-метр». Птица, выращиваемая на кормах для бройлеров, взвешивалась при рождении, в 7, 14, 21, 34, 40, 49, 56, 63 и 70 дней. Птица, выращиваемая на кормах для кур-несушек, взвешивалась при рождении, в 7, 14, 21, 34, 40, 49, 56, 63 и 90 дней.

Определение генотипов по замене rs313744840 в гене миостатина проводили методом полимеразной цепной реакции с последующей рестрикцией. Для проведения ПЦР использовали праймеры следующего состава: прямой 5’-aac-caa-tcg-tcg-gtt-ttg-ac-3› и обратный 5›-cgt-tct-ctg-tgg-gct-gac-ta-3› [5]. С их помощью ам-плифицировали один участок экзона 1 миостатинового гена (AF346599). Продукты амплификации подвергали обработке ферментом рестрикции HpaII, разрезающим ДНК в определенной точке в положении rs313744840. В этом месте гена миостатина происходит однонуклеотидная замена G/A.

ПЦР осужествляли на амплификаторе «BioRad» (США) с использованием ре- акционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl pH 8,6, 2,5 мM MgCl2, 16,6 мM NH4OH, 0,125 мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров, 50-100 нг геномной ДНК и 2,5 ед Taq-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск). Общий объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Весь процесс включал в себя 35 циклов, состоящих из повторяющихся этапов денатурации ДНК (30 сек, 94°С), отжига праймеров (30 сек, 60°С) и элонгации (30 сек, 72°С).

Фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в горизонтальном 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в течение 1 часа при рабочем напряжении 7,5 В/см в ТВЕ буфере (45 мМ трис-борат, 1 мМ ЭДТА). В качестве маркера, который определяет длину полученных в ходе реакции фрагментов ДНК на геле, использовали pUC19/MspI (Thermo Fisher Scientific). Сигнал фотографировали в системе гель-документации фирмы Кодак.

Средние показатели живой массы по группам птицы, а также достоверность разницы между группами определялась с помощью программы SigmaPlot.

Результаты исследования

У петушков, выращенных на бройлерном корме, наибольшими привесам отличались гетерозиготы AG по замене rs313744840 в гене MSTN (табл. 1) . Причем они начали достоверно (p<0,05) отличаться от своих сверстников с генотипами AA и GG уже с 14-дневного возраста. Значительные отличия наблюдались между гетерозиготами AG и гомозиготами GG к возрасту 63 дней.

Достоверные отличия отмечены и между петушками AG и гомозиготами АА, хотя в этом случае преимущество гетерозигот не было выражено так ярко.

Таблица 1. Живая масса в разные периоды жизни петушков пушкинской породы, выращенных на кормах для бройлеров, в зависимости от генотипа по замене rs313744840 в гене миостатина (1,2 – группы, разница между которыми достоверна, p<0,05)

Возраст цыпленка	Живая масса (г) в зависимости от генотипа по rs313744840 в гене MSTN			P
	АА (n=13)	AG (n=30)	GG (n=9)
Первые сутки	40,627±0,985	40,797±1,015	41,063±0,720	0,539
7 дней	68,907±1,7992	70,200±1,3291,2	61,956±2,1411	0,013
14 дней	127,000±4,5412	128,014±2,8221,2	109,563±3,8731	0,009
21 день	221,679±7,2582	226,257±5,1621,2	190,667±6,6551	0,004
28 дней	335,143±10,2622	345,855±7,9341,2	291,389±8,8511	0,003
34 дня	480,500±13,1882	492,323±9,2841,2	417,222±13,7141	<0,001
40 дней	665,929±16,3262	670,484±11,4941,2	586,500±21,2491	0,003
49 дней	928,571±22,2602	937,452±14,6511,2	812,111±27,1131	<0,001
56 дней	1064,077±23,5862	1048,815±19,5701,2	923,667±33,3531	0,003

Возраст цыпленка	Живая масса (г) в зависимости от генотипа по rs313744840 в гене MSTN			P
	АА (n=13)	AG (n=30)	GG (n=9)
63 дня	1272,583±25,8572	1241,692±23,1051,2	1116,125±38,5471	0,008
70 дней	1387,667±39,7932	1389,760±36,2591,2	1151,125±56,2691	0,003

У петушков, выращенных на обычном корме, гомозиготы АА превосходили сверстников по живой массе до возраста 56 дней (различия не достоверны) (табл. 2) . В этот период «лучшими» по живой массе оказались гетерозиготы AG (среднее значение по группе составило 1067,444±31,055г). Они же и сохранили преимущество в живой массе до конца периода наблюдений, хотя от сверстников с генотипом GG практически не отличались.

К возрасту 90 дней петушки с генотипом АА (n=7) существенно отстали от сверстников. Средняя живая масса особей этой группы составила 1509,000±48,022 г. Гетерозиготы AG (n=18) в этом возрасте весили в среднем 1631,889±53,539 г, а гомозиготы GG (n=17) - 1629,824±60,847 г. Наблюдаемые различия не достоверны. Группы с разными генотипами отличаются разнообразием по живой массе, о чем говорит большое значение стандартной ошибки.

Таблица 2. Живая масса в разные периоды жизни петушков пушкинской породы, выращенных на кормах для несушек, в зависимости от генотипа по замене rs313744840 в гене миостатина

Признак	Живая масса (г) в зависимости от генотипа по rs313744840 в гене MSTN			P
	АА (n=7)	AG (n=21)	GG (n=18)
Первые сутки	41,929±0,222	41,919±0,525	43,426±2,604	0,794
7 дней	69,2000±4,302	66,167±1,474	65,379±1,660	0,537
14 дней	123,143±7,526	118,286±3,878	115,833±3,690	0,639
21 день	218,250±14,224	213,810±7,074	210,553±7,039	0,867
28 дней	332,357±13,650	319,925±9,579	323,632±9,853	0,800
34 дня	467,500±16,049	447,643±12,740	459,105±13,792	0,680
40 дней	631,143±15,670	604,286±16,751	622,684±15,971	0,584
49 дней	884,167±24,504	866,429±22,262	881,474±19,920	0,845
56 дней	1006,857±15,893	1067,444±31,055	1064,278±29,109	0,490
63 дня	1228,143±31,943	1309,889±43,032	1306,118±48,174	0,561
90 дней	1509,000±48,022	1631,889±53,539	1629,824±60,847	0,434

При сравнении петушков с гетерозиготным генотипом AG по замене rs313744840

в гене MSTN, выращенных на разном типе корма можно отметить, что петушки, выращиваемые на бройлерных кормах, достоверно превосходили по показателям живой массы своих сверстников практически в течение всего периода наблюдения (табл. 3) .

Таблица 3. Сравнительный анализ динамики роста живой массы у петушков пушкинской породы с генотипом АG по замене rs313744840 в гене MSTN, выращенных на различных кормах

Возраст цыпленка	Живая масса (г) петушков с генотипом АG по rs313744840 в гене MSTN		Значение t-критерия Стьюдента
	выращенных на корме для молодняка кур-несушек (n=30)	выращенных на корме для бройлеров (n=21)
Первые сутки	40,797±1,015	41,919±0,525	0,98
7 дней	70,200±1,329	66,167±1,474	2,03(р<0,05)
14 дней	128,014±2,822	118,286±3,878	2,03(р<0,05)
21 день	226,257±5,162	213,810±7,074	1,42
28 дней	345,855±7,934	319,925±9,579	2,08 (р<0,05)
34 дня	492,323±9,284	447,643±12,740	2,83 (р<0,05)
40 дней	670,484±11,494	604,286±16,751	3, 26 (р<0,05)
49 дней	937,452±14,651	866,429±22,262	2,66 (р<0,05)
56 дней	1048,815±19,570	1067,444±31,055	0,51

Влияние кормления на рост и развитие молодняка различных видов животных, в том числе и сельскохозяйственной птицы, сложно переоценить. При несбалансированном или недостаточном кормлении организм просто не получит необходимый строительный материал для формирования органов и тканей. И, кроме того, не будет раскрыт генетический потенциал животного.

Пушкинская порода кур является породой мясо-яичного направления продуктивности. Курочки этой породы ‒ хорошие несушки, а достаточное количество мяса можно получить и от курочек, и от петушков. Это делает представителей пушкинской породы привлекательными для птицеводов-любителей [7]. Комбинированная продуктивность и высокое генетическое разнообразие позволили использовать эту птицу как модельный объект для научных исследований [8].

Работа гена миостатина MSTN обусловливает формирование мышечной массы у высших позвоночных животных и птиц. Продуктом гена является белок миостатин, который подавляет рост мышечной массы в организме, а также обусловливает дифференцировку мышц. Он выступает в качестве негативного регулятора массы скелетных мышц и действует по принципу обратной связи. С увеличением массы мышц возрастает и секреция миостатина, что тормозит дальнейший рост мускулатуры [1].

Спонтанные мутации, которые приводят к уменьшению количества миостатина и/или подавляют его функции, обнаружены как у человека, так и у сельскохозяйственных животных и птиц. К настоящему времени выявлено множество однонуклеотидных замен в гене MSTN, влияющих на скорость роста, показатели воспроизводства, а также состав мяса и его качество [4, 9]. В различных породах овец, свиней, собак и кур определены мутации в некодирующих регуляторных областях, что влияет на уровень экспрессии MSTN, а, следовательно, на рост и объём мышечной массы [10-12]. Изучалось влияние SNP в этом гене на живую массу в различных условиях выращивания и смертность цыплят [5].

Взаимосвязь между живой массой кур и петухов различных пород и заменой А>G в положении rs313744840 в гене миостатина наблюдалась и ранее [6, 9]. Показано, что особи, несущие аллель А по этой замене, обладали повышенной скоростью роста.

В проведенном исследовании среди петушков, выращенных на бройлерных кормах, преимуществом в росте обладали гетерозиготные особи с генотипом AG (см. табл. 1). В случае, когда молодняк рос на кормах для несушек, петушки с генотипом АА превосходили по живой массе сверстников (см. табл. 2). Можно предположить, что у гетерозигот АG по изучаемой замене есть значительный потенциал для роста, который не всегда может быть реализован в полной мере на кормах для молодняка кур-несушек. В то же время гетерозиготы по замене rs313744840 в гене MSTN, выращенные на кормах для бройлеров превосходили своих сверстников, выращенных на обычном корме (см. табл. 3).

Данное исследование выполнено при финансовой поддержке ФАНО России в рамках ГЗ АААА-А18-118021590138-1 с использованием популяций кур из био-ресурсной коллекции ЦКП «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (ВНИИГРЖ, Санкт-Петербург – Пушкин).

Выводы

У петушков, выращенных на бройлерном корме, наибольшими привесам отличались гетерозиготы AG. Причем они начали достоверно (p<0,05) отличаться от своих сверстников с генотипом GG уже с 14-дневного возраста.

У петушков, выращенных на корме для выращивания несушек, гомозиготы АА превосходили сверстников по живой массе до возраста 56 дней (различия не достоверны).

Среди петушков старше 56 дней, выращенных на обычном корме, «лучшими» по живой массе оказались гетерозиготы AG (среднее значение по группе составило 1067,444±31,055г). Они же и сохранили преимущество в живой массе до конца периода наблюдений, хотя от сверстников с генотипом GG практически не отличались.

К возрасту 90 дней петушки с генотипом АА (n=7) существенно отстали от сверстников. Средняя живая масса особей этой группы составила 1509,000±48,022 г. Гетерозиготы AG (n=21) в этом возрасте весили в среднем 1631,889±53,539 г, а гомозиготы GG (n=18) - 1629,824±60,847 г. Наблюдаемые различия не достоверны. Группы с разными генотипами отличаются разнообразием по живой массе, о чем говорит большое значение стандартной ошибки.

У петушков быстрее росли особи с гетерозиготным генотипом AG по замене rs313744840 в гене MSTN. При этом петушки, выращиваемые на бройлерных кормах, достоверно превосходили по показателям живой массы своих сверстников практически в течение всего периода наблюдения.

Использование корма с повышенным содержанием протеина и обменной энергии позволяет реализовать генетический потенциал птицы.