Влияние «Симбион-Д» на микробный состав кишечника и иммунитет телят при диспепсии

Введение. Известно, что из всех биотопов животного наиболее представительна микробиота желудочно-кишечного тракта, важная роль которой состоит в поддержании высокого физиологического и иммунного статуса [1]. Будучи стерильным внутриутробно [2, 3], рубец новорожденного теленка подвергается быстрой колонизации микроорганизмами во время родов и после рождения от матери [4] и источников окружающей среды [5]. После первоначальной колонизации в недоразвитом рубце телят уже на третий день жизни регистрируют группы микроорганизмов, критически важных для ферментации поступающего корма. С возрастом, по мере увеличения потребления твердых кормов, микробиота рубца у молодых жвачных приобретает состав, свойственный взрослому животному [6].

В физиологическом формировании микробиоценоза кишечника новорожденного теленка определяющую роль играет молозиво. Это единственный источник иммуноглобулинов у новорожденных телят, следовательно, их иммунной защиты [7]. Иммунитет коров-матерей, передающийся потомству с антителами через молозиво, имеет тенденцию к быстрому снижению, что приводит к высокой заболеваемости

Цель исследований – изучение влияния биологически активной композиции микробного происхождения (БАКМП) «Симбион-Д» на микробный состав кишечника и иммунитет телят при диспепсии.

Задачи: определить микробный состав кишечника новорожденных телят до и после применения БАКМП «Симбион-Д»; оценить иммунный статус новорожденных телят до и после применения БАКМП «Симбион-Д».

Объекты и методы. Объекты исследований: телята возраста до 14 дней, венозная кровь, фекалии, экспериментальный образец БАКМП «Симбион-Д».

Исследования проведены на базе кафедры болезней продуктивных животных (кафедра на производстве) на телятах периода новорожден-ности голштинской породы до 14 сут, рожденных в осенний период времени и принадлежащих ФГУП «Омское». После рождения телят помещают в телятник в клетки группами по 10 голов на глубокую соломенную подстилку. Молозиво выпаивают в течение часа после рождения в объеме от 0,5 до 4 л из ведра для поения с соской и клапаном. Регистрировали случаи задержки выпаивания молозива телятам более трех часов с момента их рождения. Со второго дня жизни телятам выпаивают пастеризованное молоко согласно норме потребления. Начиная только с 3–4-й недели жизни в кормушки телятам добавляют концентраты и сено. Водопой осуществляется водопроводной водой из корыт.

В контрольную группу животных были отобраны телята без признаков диареи (n = 5), находящиеся под ежедневным клиническим наблюдением. Критерием включения в опытную группу телят был клинический признак «диарея» (n=60). Телятам опытной группы ежедневно, в течение 5–7 дней, выпаивали БАКМП «Симбион-Д» в дозе 20–30 мл на голову индивидуально в зависимости от массы теленка и тяжести заболевания. БАКМП «Симбион-Д» является продуктом метаболизма уксуснокислых бактерий и дрожжей в комплексе с полисахаридом и представляет собой опалесцирующую жидкость светло-коричневого цвета, от слабовязкой до вязкой консистенции, кисло-сладкого вкуса, для внутреннего применения.

Для изучения кишечной микробиоты животных пробы отбирали из прямой кишки от трех голов, а иммунного статуса – от пяти голов из каждой экспериментальной группы. Пробы были получены в начале эксперимента (фон) и после курса применения БАКМП «Симбион-Д» (через 7 сут). Исследования микробного состава кишечника проводили в БУ «Омская областная ветеринарная лаборатория». В пробах определяли качественный и количественный состав микрофлоры методом разведения и посевом на элективные питательные среды. Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили, используя определитель зоопатогенных микроорганизмов [14].

Оценку неспецифической резистентности молодняка крупного рогатого скота проводили с помощью методов оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в отделе ветеринарии Омского аграрного научного центра. С этой целью определяли в периферической крови телят концентрацию Т-, В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) – методом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 6 000 по Ю. А. Гриневич и А.Н. Алферову [15]. Лизосомаль-но-катионные белки (ЛКБ) – по методу М. Г. Шубича с бромфеноловым синим, активность миелопероксидазы – по методу Грэхем-Кнолля с использованием бензидина. Также оценивали кислородпродуцирующую активность нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) в спонтанном (НСТсп) и стимулированном (НСТст) вариантах с фотометрической оценкой результата. Дополнительно рассчитывали коэффициент стимуляции (КС=НСТсп/НСТст). Количество лейкоцитов и лейкограмму определяли общепринятыми методами анализа [16].

Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет программы STATISTICA 10,0. Для оценки различий между двумя независимыми выборками использовали U-критерий Манна-Уитни, достоверной считали разницу при р < 0,05. Для оценки различий между двумя зависимыми выборками использовали критерий Вилкоксона, достоверной считали разницу при р < 0,05.

Результаты и их обсуждение. Фоновые показатели микробиоты желудочно-кишечного тракта телят представлены в таблице 1.

Таблица 1

Состав микроорганизмов в 1 г фекалий телят до введения «Симбион-Д» (фон)

Вид микроорганизма	Количество микроорганизмов, КОЕ/г
	Контроль			Опыт			Норма
	Номер теленка
	181	193	199	5400	5408	5410
Escherichia coli	1,3·106	4,8·104	5,7·106	9·105	1,4·108	1·105	106–107
Staphylococcus epidermidis	> 1·105	1·103	1·103	1·103	>1·105	>1·105	До 103
Proteus spp.	–	1·107	–	1·105	–	1·105	До 103
Candida albicans	–	–	–	–	–	–	До 103
Bifidobacterium spp.	10 10	109	109	10 10	10 10	109	107–109
Lactobacillus spp.	108	< 105	< 105	< 105	< 105	< 105	106–107
Итого показателей отклонения от нормы	6			9			–

Здесь и далее : «–» – отсутствие роста.

Анализ результатов свидетельствует о том, что у пяти телят обеих экспериментальных групп отмечали низкое содержание молочнокислых микроорганизмов рода Lactobacillus spp. Только у одного теленка контрольной группы количество микроорганизмов было на уровне нормальных разведений. При этом количество микроорганизмов рода Bifidobacterium spp. у здоровых и больных телят было на уровне физиологических показателей. У двух больных телят из трех были выделены микроорганизмы рода Proteus spp . выше допустимых значений. В контрольной группе были выделены микроорганизмы рода Proteus spp. в разведении

1·10⁷ КОЕ/г только у одного теленка. У всех телят опытной и контрольной групп отмечали увеличение количества условно-патогенной микрофлоры, а именно Staphylococcus epidermidis от 1·10³ КОЕ/г и более 1·10⁵ КОЕ/г. Однако увеличение количества микроорганизмов рода Escherichia coli регистрировали только у одного теленка опытной группы.

Таким образом, у здоровых телят отклонение от физиологической нормы наблюдали по девяти микробиологическим показателям.

Результаты исследования кишечного микробиома телят через 7 сут представлены в таблице 2.

Таблица 2

Состав микроорганизмов в 1 г фекалий телят после введения «Симбион-Д» (через 7 сут)

Выделенная культура	Количество микроорганизмов, КОЕ/г
	Контроль			Опыт			Норма
	Номер теленка
	181	193	199	5400	5408	5410
Escherichia coli	7,2·102	2·108	1·105	1,3·106	1,6·108	2,2·106	106–107
Staphylococcus epidermidis	1·103	1·103	< 1·103	1·103	< 1·103	1·103	До 103
Proteus spp.	–	–	–	–	–	1·105	До 103
Candida albicans	1·103	1·103	–	–	1·103	–	До 103
Bifidobacterium spp.	10 10	109	109	10 10	109	10 10	107–109
Lactobacillus spp.	108	< 105	< 105	< 105	< 105	108	106–107
Итого показателей отклонения от нормы	7			7			–

Анализ результатов микробиологических исследований телят опытной и контрольной групп показал, что через 7 сут количество молочнокислых бактерий рода Lactobacillus spp. преимущественно не изменяется. Только у одного теленка опытной группы регистрировали увеличение количества микроорганизмов до ×10⁸ КОЕ/г. Содержание Bifidobacterium spp . в контрольной и опытной группах осталось без изменений. Следует подчеркнуть, что у двух телят контрольной группы из трех были зарегистрированы микроорганизмы Candida albicans (1·10³ КОЕ/г). На фоне применения испытуемого симбиотика дрожжеподобные грибы были обнаружены только у одного теленка. У одного теленка опытной группы количество микроорганизмов рода Proteus spp. уменьшилось, а у одного осталось на прежнем уровне (1·10⁵ КОЕ/г). В контрольной и опытной группах были зарегистрированы случаи снижения количества Staphylococcus epidermidis с 1·10⁵

до 1·10³ КОЕ/г. У одного теленка контрольной группы отмечали увеличение содержания Escherichia coli до 2·10⁸ КОЕ/г. Пероральное применение БАКМП «Симбион-Д» в течение семи дней больным телятам не оказывало влияния на содержание Escherichia coli.

Таким образом, через неделю после начала эксперимента у здоровых телят регистрировали увеличение числа показателей отклонения от нормальных значений до семи. Ежедневное применение БАКМП «Симбион-Д» в дозе 20– 30 мл/гол. больным диспепсией телятам способствовало снижению числа микробиологических показателей отклонений от физиологической нормы с 9 до 7.

Результаты иммунологических исследований крови телят экспериментальных групп представлены в таблице 3 в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего значения (М ± sem).

Таблица 3

Показатель	Фон	Через 7 дней	Фон	Через 7 дней
Группа	Контроль		Опыт
Лейкоциты, тыс/мкл	8,8±0,85	8,18±0,64**	7,6±2,03	7,08±1,4
Лимфоциты, %	56,6±13,45	55,2±10,99	39,6±14,19	48,4±6,84
Лимфоциты, тыс/мкл	4,94±1,15	4,47±0,65	2,94±0,96*	3,37±0,42
Нейтрофилы, %	41,6±13,81	43,8±10,73	59,6±14,54	50,2±7,98
Т-лимфоциты, %	15,6±1,95	14,4±2,7	23,0±7,52*	29,4±1,95*
Т-лимфоциты, тыс/мкл	0,78±0,23	0,65±0,2**	0,7±0,36	0,99±0,15*
В-лимфоциты, %	33,4±6,91	26,6±4,56**	41,2±7,29	29,8±4,76
В-лимфоциты, тыс/мкл	1,65±0,55	1,17±0,17**	1,24±0,51	1,0±0,21
Цитотоксические Т-лимфоциты, %	31,8±7,01	26,6±6,58	47,6±6,58*	38,0±2,92***
Цитотоксические Т-лимфоциты, тыс/мкл	1,59±0,6	1,18±0,31	1,36±0,35	1,29±0,24
ЛКБ-тест, у.е.	2,01±0,24	1,95±0,06	2,09±0,36	2,24±0,1**
Спонтанный НСТ-тест ,у.е.оп.пл	0,18±0,09	0,24±0,07	0,13±0,06	0,12±0,02*
А/ген НСТ-тест ,у.е.оп.пл	0,16±0,05	0,29±0,11	0,11±0,01*	0,4±0,16**
К ст. НСТ	0,92±0,17	1,3±0,52	0,91±0,28	3,44±1,47***
ЦИК, у.е.	25,0±8,06	22,8±4,92	20,8±4,87	25,0±4,18

Примечание: * – уровень значимости по отношению к группе контроля; ** – уровень значимости в сравнении с фоновыми показателями; *** – уровень значимости по отношению к фоновым показателям и показателям контрольной группы

Анализ показателей естественной резистентности организма телят при применении БАКМП «Симбион-Д»

У телят контрольной группы (здоровые телята) среднее количество лейкоцитов в крови было выше на 16 %, чем у телят опытной группы. При этом курсовое введение симбиотика не оказывало влияния на их содержание через 7 сут. Абсолютное число лимфоцитов у телят опытной группы перед началом лечения было достоверно снижено на 40 % (р ≤ 0,05) по сравнению с аналогичным показателем крови телят контрольной группы. Через 7 сут ежедневного применения БАКМП «Симбион-Д» отмечали тенденцию к повышению абсолютного количества лимфоцитов на 15 % по сравнению с фоновыми показателями. Аналогичную закономерность отмечали при анализе относительного содержания лимфоцитов у телят опытной группы. У телят контрольной группы через 7 сут после начала эксперимента отмечали снижение числа Т-лимфоцитов на 17 %.

У телят опытной группы, наоборот, регистрировали достоверное повышение данного показателя на 52 % (р ≤ 0,05) по сравнению с группой контроля. Фоновое относительное количество цитотоксических Т-лимфоцитов у телят опытной группы было достоверно выше на 50 % (р ≤ 0,05) по сравнению с показателем группы контроля. Пероральное применение БАКМП «Симбион-Д» в течение семи дней способствовало достоверному снижению данного показателя на 20 % (р≤0,05) по сравнению с фоном. Абсолютные значения концентрации цитотоксических Т-лимфоцитов не имели статистически значимой разницы между экспериментальными группами. Подобную закономерность регистрировали при анализе содержания абсолютного количества В-лимфоцитов в крови телят обеих экспериментальных групп. Относительное количество В-лим-фоцитов в течение экспериментального периода имело тенденцию к понижению у телят контрольной группы на 20 % и телят опытной группы на 28 %. Относительное количество нейтрофилов у телят экспериментальных групп не имело статистически значимой разницы.

При анализе показателя ЛКБ-теста у телят контрольной группы достоверно значимой разницы между показателями фона и через семь дней после начала эксперимента установлено не было. Пероральное введение исследуемого симбиотика в течение семи дней способствовало повышению данного показателя на 7 % по сравнению с фоновыми показателями и на 14 % по сравнению с группой контроля. У больных телят отмечали снижение показателя спонтанного НСТ-теста на 28 % по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. Показатель антигенной стимуляции нейтрофилов у телят на фоне введения БАКМП «Симбион-Д» достоверно повышается более чем в 2 раза (р ≤ 0,05). Уровень циркулирующих иммунных комплексов не имел достоверно значимой разницы между группами.

Заключение. Таким образом, ежедневное пероральное введение в течение 7 сут БАКМП «Симбион-Д» в дозе 20–30 мл на голову телятам при токсической форме диспепсии способствует нормализации кишечного микробиома, стимуляции Т-клеточного иммунитета и активации показателей неспецифической резистентности.